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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.75.2020.tde-23102020-102820
Documento
Autor
Nombre completo
Bruno Rafael Araujo
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Carlos, 2020
Director
Tribunal
Carrilho, Emanuel (Presidente)
Sussulini, Alessandra
Azevedo, Eduardo Bessa
Hantao, Leandro Wang
Pereira, Fabiola Manhas Verbi
Título en portugués
Metabolômica untargeted em urina de portadores de Cri Du Chat utilizando cromatografia a gás e espectrometria de massas (GC-MS)
Palabras clave en portugués
fingerprinting metabólico
ácidos orgânicos
metabolômica untargeted
síndrome do Cri Du Chat
urina seca em papel
Resumen en portugués

No primeiro e segundo capítulos desta tese, duas abordagens metabolômicas untargeted fingerprinting e perfil metabólico de ácidos orgânicos utilizando urina de portadores e não-portadores da síndrome Cri Du Chat (CDC) foram aplicadas para avaliar possíveis alterações nas vias bioquímicas devido à condição genética. Inicialmente, o melhor solvente para precipitação de proteínas/extração de metabólitos foi avaliado, seguido por planejamento fatorial 23 para otimização das condições de derivação das amostras. Adicionalmente, três diferentes sistemas de extração líquido-líquido de ácidos orgânicos foram avaliados. Os metabólitos derivatizados foram analisados por cromatografia a gás e espectrometria de massas (GC-MS) nas condições: temperatura do injetor, da interface do MS e da fonte de íons em 250, 290 e 250 ºC, respectivamente; modo scan (45-600 m/z). Métodos univariados e multivariados de análise como análise de componentes principais (PCA), análise discriminante pelo método de mínimos quadrados parciais (PLS-DA), teste-t foram aplicados para discriminação dos grupos controle, e os metabólitos com valores de importância variável na projeção (VIP) maiores que 1,0 e p < 0,05 foram selecionados como os responsáveis pela separação entre os grupos. Deste modo, metanol e um método adaptado de extração líquido-líquido foram selecionados como o melhor solvente e melhor método de extração de ácidos orgânicos, respectivamente, por obterem maiores números de metabólitos identificados com altas intensidades e com boa reprodutibilidade entre as medidas. Temperatura e tempo de derivação (60 ºC e 120 min, respectivamente), e 400 µL de urina foram as melhores condições selecionadas devido ao número de múltiplas respostas obtidas. Porém, volumes de urina e reagentes de derivação foram reduzidas à metade (urina: 200 µL; cloridrato de metoxiamina em piridina (MeOx) e N-metil-N-(trimetilsilil)trifluoroacetamida (MSTFA): ambos 25 µL) devido à redução de custos, mas sem interferir na qualidade dos dados cromatográficos. Utilizando as duas abordagens metabolômicas, diferentes vias bioquímicas foram alteradas devido à condição genética: para o fingerprinting metabólico, o metabolismo da glicólise/gliconeogênese, da fenilalanina, da tirosina e da sacarose e amido foram as vias mais impactadas devido a síndrome CDC; e para o perfil metabólico, o metabolismo do triptofano, da tirosina/fenilalanina, e de polifenóis produzidos pela ação da microflora intestinal. Esses resultados correlacionam as alterações bioquímicas e moleculares com as características fenotípicas associadas à síndrome CDC. No terceiro capítulo, amostras de urina foram depositadas e secas em papel filtro Whatman® 903 (1,4 cm × 2,5 cm) para avaliação da conservação do perfil metabólico urinário conforme o tempo de armazenamento (1, 5, 10 e 30 dias) e sob o efeito da temperatura (−20 °C e 25 °C). Após os tempos previamente estabelecidos, a urina foi dessorvida do papel utilizando água deionizada e os metabólitos recuperados foram derivados com MeOx e MSTFA e analisados por GC-MS. O método de análise univariada teste-t foi utilizado para avaliação estatística dos dados. Desse modo, os perfis cromatográficos das amostras de urina depositadas em papel foram similares sob as diferentes condições de armazenamento, bem como perfis semelhantes entre amostras depositadas e seca em papel com a amostra de urina analisada diretamente e foram observadas, mostrando que os perfis metabólicos são conservados ao longo do tempo, sob diferentes temperaturas, e utilizando a técnica de deposição e secagem da urina em papel filtro. Não houve diferença estatística significativa (p > 0,005) entre as intensidades dos metabólitos identificados em relação ao tempo e temperatura de armazenamento, o que mostra a não necessidade de baixas temperaturas para garantir a estabilidade química dos metabólitos ao longo do tempo de armazenamento quando a urina é depositada em papel filtro. Portanto, a partir desse comportamento tem-se que o papel filtro pode ser utilizado para a coleta e o armazenamento de urina em modo simples para posterior determinação de biomarcadores para diversas doenças.

Título en inglés
Untargeted metabolomics in urine samples of Cri Du Chat syndrome individuals by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)
Palabras clave en inglés
Cri Du Chat syndrome
dried urine on paper
metabolic fingerprinting
organic acids
untargeted metabolomics
Resumen en inglés

In the first e second chapters of this thesis, two untargeted metabolomics approaches (fingerprinting and metabolic profiling of organic acids) using urine of Cri Du Chat (CDC) syndrome carriers and non-carriers were applied to study possible biochemical pathways altered due to the syndrome. Firstly, the best solvent for precipitation of proteins/extraction of metabolites was assessed, followed by full-factorial design (23) for optimization of the conditions of sample derivatization. Also, three different systems of liquid-liquid extraction of organic acids were assessed. The derivatized metabolites were analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) in the conditions: injector, MS interface, and ion source temperatures were 250, 290, and 250 °C, respectively; scan mode (45-600 m/z). Multivariate and univariate methods as principal component analysis (PCA), partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), t-test were applied to distinguish groups, and metabolites with values of variable importance in projection (VIP) higher than 1.0 and p < 0.05 were responsible for discrimination between groups. In this way, methanol and an adapted liquid-liquid extraction method were selected as the best solvent for obtaining a greater number of metabolites identified with higher intensities and with good reproducibility between measurements. Temperature and time of derivatization (60 °C and 120 min, respectively), and 400 µL of urine sample were the selected conditions because of the number of multiple responses obtained. However, volumes of the urine and derivatization reagents were halved (urine: 200 µL; methoxyamine hydrochloride in pyridine and N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide: both 25 µL) due to the reduction of costs, and that resulted in no changes in data quality. Using two metabolomics approaches, different biochemical pathways were altered due to the genetic condition (fingerprinting: glycolysis/gluconeogenesis, phenylalanine, tyrosine, and sucrose and starch metabolisms; metabolic profiling: tryptophan, tyrosine/phenylalanine metabolisms, and polyphenol metabolism, produced by the action of the microflora). These findings correlate the molecular biochemical alterations with phenotypical characteristics associated to the CDC syndrome. In the third chapter, urine samples were deposited and dried on a Whatman® 903 (1.4 cm × 2.5 cm) filter paper to evaluate the conservation of the urinary metabolic profile according to storage time (1, 5, 10 and 30 days) and temperature (–20 °C and 25 °C). After the established times, the urine was desorbed from the paper using deionized water and the recovered metabolites were derivatized with MeOx and MSTFA and analyzed by GC-MS. The univariate analysis t-test method was used for statistical evaluation of the data. Thus, the chromatographic profiles of the urine samples deposited on paper were similar under different storage conditions, as well as similar profiles between deposited samples and paper dried with the urine sample directly analyzed and were observed, showing that the metabolic profiles are preserved over time, under different temperatures, and using the technique of deposition and drying of urine on filter paper. There was no statistically significant difference (p > 0.005) between the intensities of the metabolites identified in relation to storage time and temperature, which shows no need for low temperatures to ensure the chemical stability of the metabolites over the storage time when urine is deposited on filter paper. Therefore, from this behavior we learned that the filter paper can be used for the collection and storage of urine in a simple mode for further determination of biomarkers for several diseases.

 
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Fecha de Publicación
2020-10-27
 
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