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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.75.2021.tde-30062021-152518
Documento
Autor
Nome completo
Noeli Soares Melo da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2021
Orientador
Banca examinadora
Borges, Júlio César (Presidente)
Figueira, Ana Carolina Migliorini
Foguel, Debora
Garratt, Richard Charles
Thiemann, Otavio Henrique
Título em português
Caracterização estrutural, funcional e estabilidade térmica das proteínas humanas HspA5 e HspA8: uma abordagem comparativa
Palavras-chave em português
Homo sapiens
HSPA5
HSPA8
chaperonas moleculares
Hsp70
Resumo em português
As proteínas de choque térmico (Hsps) são componentes importantes do controle de qualidade proteico celular (PQC), atuando na síntese, enovelamento, transporte de proteínas e marcação de proteínas para degradação. O componente central no PQC é a família Hsp70, que consiste em chaperonas moleculares altamente conservadas, ubíquas e ATP-dependentes. Estas chaperonas podem assumir diferentes conformações que são reguladas por sua associação dinâmica com os nucleotídeos adenosina (ATP e ADP), bem como por sua interação com co-chaperonas e proteínas-clientes. Nos seres humanos existem várias proteínas Hsp70, sendo a maioria delas encontrada no citoplasma, enquanto outras são específicas de organelas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar estruturalmente e funcionalmente as proteínas Hsp70 humanas citossólica (HspA8) e do retículo endoplasmático (HspA5), por meio de metodologias similares. Para tal, as proteínas hHsp70 recombinantes foram expressas, purificadas e então caracterizadas quanto à estrutura, estabilidade e função por meio de testes biofísicos. Os resultados mostram que as proteínas HspA5 e HspA8 foram produzidas em suas formas enoveladas, com conteúdo de estrutura secundária majoritário em hélices-? e como monômeros levemente alongados em solução. Tais Hsp70 apresentaram estabilidades química e térmica similares, contudo foram observadas duas transições térmicas para a HspA5 e três para a HspA8, indicando diferenças estruturais que resultam em estabilidades térmicas distintas. A presença de nucleotídeos adenosina causou alterações nos conteúdos de estrutura secundária e terciária em ambas as proteínas, os quais também causaram a estabilização térmica das hHsp70. A presença dos íons Ca2+ e Mg2+ favoreceu a ligação das hHsp70 aos nucleotídeos ATP e ADP de formas distintas, e diferentemente da HspA5, a proteína HspA8 interagiu com o Ca2+ mesmo na ausência dos nucleotídeos. Um processo termodinamicamente regido por entalpia e entropia foi observado para a interação dos nucleotídeos adenosina com as proteínas HspA5 e HspA8. As hHsp70 apresentaram atividade ATPásica similar e relativamente baixa, contudo a afinidade da HspA5 pelo ATP foi maior do que a da HspA8. Adicionalmente, as proteínas HspA5 e HspA8 foram eficazes na prevenção da agregação de proteínas-clientes modelo, apresentando diferentes especificidades. Em suma os dados obtidos demonstram que, embora compartilhem 66% de identidade, as proteínas humanas HspA5 e HspA8 apresentam peculiaridades estruturais e funcionais, enriquecendo, portanto, o conhecimento acerca de tais macromoléculas.
Título em inglês
Structural, functional characterization and thermal stability of human proteins HspA5 and HspA8: a comparative approach
Palavras-chave em inglês
Homo sapiens
HSPA5
HSPA8
Hsp70
molecular chaperones
Resumo em inglês
Heat shock proteins (Hsps) are important components of cell protein quality control (PQC), acting on protein synthesis, folding, traffic and degradation. The central component in the PQC is the Hsp70 family, which consists of highly conserved, ubiquitous and ATP-dependent molecular chaperones. These chaperones can assume different conformations that are regulated by their dynamic association with the adenosine nucleotides (ATP and ADP), as well as by their interaction with co-chaperones and client proteins. In humans there are several Hsp70 proteins, most of which are found in the cytoplasm, while others are specific for organelles. The objective of this work was to structurally and functionally characterize the cytosolic (HspA8) and endoplasmic reticulum (HspA5) human Hsp70 proteins, using similar methodologies. For this, the recombinant hHsp70 proteins were expressed, purified and then characterized for structure, stability and function by means of biophysical tests. The results show that the HspA5 and HspA8 proteins were produced in their folded form, with secondary structure content rich in ?-helices and as slightly elongated monomers in solution. Such Hsp70 showed similar chemical and thermal stability, however two thermal transitions (Tm) were observed for HspA5 and three for HspA8, indicating structural differences that result in distinct thermal stability. Changes in secondary and tertiary structure were observed in the proteins under study in the presence of nucleotides, which also caused the thermal stabilization of hHsp70. The presence of Ca2+ and Mg2+ ions favored the binding of hHsp70 to ATP and ADP nucleotides in different ways, and unlike HspA5, the HspA8 protein interacted with Ca2+ even in the absence of nucleotides. A process thermodynamically governed by enthalpy and entropy was observed for the interaction of the adenosine nucleotides with the HspA5 and HspA8 proteins. hHsp70 showed similar and relatively low ATP activity, however the affinity of HspA5 for ATP was higher than that of HspA8. Additionally, the HspA5 and HspA8 proteins were effective in preventing the aggregation of model client proteins, with different specificities. In summary, the data obtained demonstrate that, although they share 66% of identity, the human proteins HspA5 and HspA8 present structural and functional peculiarities, thus enriching the knowledge about such macromolecules.
 
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Data de Publicação
2021-07-01
 
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