A protease principal do vírus SARS-CoV-2 (M^pro) é um alvo importante no combate à COVID-19, no entanto sua eficácia pode ser prejudicada por mutações virais. A expressão e eficiência catalítica da WT M^pro e algumas variantes de preocupação (VOC) foram avaliadas usando SDS-PAGE e cinética enzimática. Foi identificado que diferentes sais cosmotrópicos, especialmente o citrato de sódio, melhora significativamente a atividade catalítica da protease, estabilizando sua forma ativa dimérica. Estudos com as diferentes variantes demonstrou que as mesmas possuem um impacto mínimo no reconhecimento de substratos distintos, sugerindo que diferentes inibidores podem ser eficazes contra todas as variantes. O fato de mutações serem infrequentes na sequência da M^pro e não alterarem o sítio ativo da proteína, destaca a sua importância contínua como alvo terapêutico. O Neq1183 (Nirmatrelvir) e inibidores peptídeo miméticos foram testados contra a WT M^pro e VOC, e suas respectivas constantes cinéticas foram determinadas. Portanto, por meio da análise de pares moleculares (MMP) e relação estrutura e atividade (SAR), identificou-se que grupos volumosos e aromáticos na posição P2 da molécula influenciam significativamente a afinidade contra a M^pro. O Neq1183 também foi estudado usando a técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) contra a WT M^pro, revelando um perfil termodinâmico favorável de interação. Diferentes warheads irreversíveis foram analisadas, apresentando potencial para o desenvolvimento de sondas baseadas em atividade (ABP). Além disso, considerando o papel da catepsina humana L (hCatL) na COVID-19, a inibição desta CP foi analisada com uma variedade de inibidores covalentes reversíveis, na qual foi identificado que o grupo indol na posição P2 da molécula é importante para atingir alta afinidade e seletividade nesta enzima frente as catepsinas humanas S e B. Logo, este estudo fornece uma compreensão abrangente da especificidade da SARS-CoV-2 M^pro, oferecendo insights para o desenvolvimento de inibidores.

The SARS-CoV-2 Main Protease (M^pro) is an essential target for combating COVID-19, but viral mutations can hamper its effectiveness. Expression and catalytic efficiency of the wild-type (WT) SARS-CoV-2 M^pro and some variants of concern (VOC) are assessed using SDS- PAGE electrophoresis and enzyme kinetics. Kosmotropes, particularly sodium citrate, significantly enhance the catalytic activity of M^pro by stabilizing its active dimeric form. The WT M^pro and variants study using a peptide small molecule and a protein-based substrate, indicate minimal impact on substrate recognition, suggesting that existing inhibitors remain effective against all variants. The infrequent mutations in M^pro's sequence and do not alter the active site of the protein, highlights its continued importance as a therapeutic target. Neq1183 (Nirmatrelvir) and peptide mimetic inhibitors were tested against both WT and VOC Mpro and their respective kinetic constants were determined. Using matched-molecular pair and structure-activity relationship (SAR), it was identified that bulky and aromatic groups at the P2 position significantly influenced affinity. Neq1183 was also investigated using isothermal titration calorimetry (ITC) against WT M^pro, revealing a favorable thermodynamic profile. Irreversible warheads were analyzed, presenting the potential for activity-based probe development. Additionally, considering the human cathepsin L (hCatL) role in COVID-19, selective inhibition of this CP was achieved with a range of covalent reversible inhibitors, revealing an essential indole group at the P2 position. Furthermore, this study provides a comprehensive understanding of SARS-CoV-2 M^pro specificity, offering insights for inhibitor development.