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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.75.2014.tde-28082014-135313
Document
Auteur
Nom complet
Juliana Moreira
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Carlos, 2014
Directeur
Jury
Canduri, Fernanda (Président)
Araujo, Ana Paula Ulian de
Dias, Marcio Vinícius Bertacine
Titre en portugais
Expressão e purificação da quinase dependente de ciclina 13 humana em sistema bacteriano
Mots-clés en portugais
CDK13
controle transcricional
fosforilação
Resumé en portugais
As quinases dependentes de ciclinas são proteínas que podem ser divididas de acordo com a sua atuação no ciclo celular ou no controle transcricional, elas se tornam ativas em determinadas etapas do ciclo celular dependendo do seu grau de fosforilação e de sua ligação com ciclinas e proteínas inibitórias, e exercem sua função fosforilando outras proteínas envolvidas no ciclo de divisão celular e transcrição influenciando suas atividades, garantindo que cada processo do ciclo ocorra em uma sequência ordenada. A CDK13 faz parte da família de proteínas quinases dependentes de ciclina, pode se ligar a ciclinas do tipo L ou K, regula os eventos de "splicing" alternativo, e interage com a proteína Tat do vírus HIV atuando como um possível fator de restrição, sendo que sua superexpressão diminui a produção de algumas proteínas virais suprimindo a produção do vírus. O DNA referente à CDK13 é replicado em células cancerosas, principalmente dos tipos hepático e cólon e reto, sendo um alvo para inibidores para tratamento de câncer. A fim de contribuir para o estudo dessa proteína, o projeto tem como objetivo expressá-la utilizando métodos de tecnologia de DNA recombinante. A sequência de DNA referente à CDK13 foi amplificada pela reação em cadeia da polimerase, após sua purificação, foi inserida no vetor pCR-Blunt e clonada em células de E. coli DH5α competentes. Porém, o DNA não foi liberado pela reação com as enzimas de restrição BamHI e NdeI. As bactérias Rosetta(DE3) transformadas com um plasmídeo sintético e crescidas em meio de auto-indução expressaram a CDK13. Após lise celular e purificação em coluna de Ni2+, a proteína foi detectada por Western Blot. Já as bactérias Rosetta(DE3) transformadas com o plasmídeo sintético modificado (o qual compreende a região do DNA que expressa o bolsão de ligação da CDK13), e induzidas em meio LB expressaram a CDK13, porém não foi possível purificá-la em coluna de afinidade ao Ni2+.
Titre en anglais
Expression and purification of human cyclin-dependent kinase 13 in bacterial system
Mots-clés en anglais
CDK13
phosphorylation
transcriptional control
Resumé en anglais
The cyclin-dependent kinases are proteins that can be classified by their function in the cell cycle or transcriptional control. They are activated in particular steps of the cell cycle depending on their phosphorylation degree, cyclin binding and inhibitory proteins. They act phosphorylating other proteins involved in the cell cycle and transcriptional control, influencing in their activities, ensuring that each step of the cell cycle occur in an ordered sequence. The CDK13 is one of the cyclin-dependent kinases family member, it can bind to L or K cyclins, regulates the alternative splicing and interact with HIV Tat protein, acting as a possible restriction factor, its overexpression decreases the production of some viral proteins, and suppresses the virus production. The DNA corresponding to CDK13 is replicated in cancer cells, mainly of hepatic and colon rectal types; therefore it is a target for inhibitors for cancer therapy. In order to contribute for the studies of this protein, the goal of the project is to express it using methods of recombinant DNA technology. The DNA sequence corresponding to CDK13 was amplified by polymerase chain reaction, after its purification, it was inserted to pCR-Blunt vector and cloned into E. coli DH5α competent cells. However, the DNA wasn't released by the BamHI and NdeI restriction enzymes. The Rosetta(DE3) cells transformed with a synthetic plasmid pET28a::CDK13 and grown in auto-induction media expressed the CDK13. After cell lysis and purification by Ni2+ affinity colum, the protein was identified by Western Blot. However, the Rosetta(DE3) cells transformed with the modified synthetic plasmid (that comprehends the DNA region which expresses the binding pocket region) induced in LB media, expressed the CDK13. Yet, it wasn't possible to purify the protein in the Ni2+ affinity column.
 
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JulianaMoreira.pdf (2.65 Mbytes)
Date de Publication
2014-12-01
 
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