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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.75.2020.tde-20052020-145630
Document
Auteur
Nom complet
Fernanda Angélica Sala
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Carlos, 2020
Directeur
Jury
Garratt, Richard Charles (Président)
Fernandes, Andrea Balan
Murakami, Mario Tyago
Borges, Júlio César
Thiemann, Otavio Henrique
Titre en portugais
Protein-protein interactions involved in copper homeostasis, oxidative aging and neurodegenerative disease
Mots-clés en portugais
cristalografia de proteínas
ELA
hCCS
heterodímero
hSOD1
modificações pós-traducionais
Resumé en portugais
Apesar do conhecimento da importância da Cu,Zn Superóxido Dismutase humana (hSOD1) em muitos processos celulares, pouco é entendido sobre os estágios finais do seu processo de maturação. Estudos ressaltam a importância da proteína auxiliar hCCS (chaperona de cobre humana para superóxido dismutase 1), que reconhece especificamente a hSOD1 recém traduzida e a ativa através da inserção do íon cobre e da oxidação da ligação dissulfeto. Entender esse mecanismo pode ser decisivo na luta contra doenças neurodegenerativas, já que formas imaturas de SOD1 são tipicamente identificadas como mais propensas à agregação. As principais dificuldades desse estudo estão na obtenção de heterocomplexos, já que eles apresentam um caráter transitório e, no comportamento da hCCS que é descrito como recalcitrante à cristalização devido à sua estrutura altamente flexível. Neste trabalho, nosso objetivo foi investigar os processos de reconhecimento e a sequência de eventos de modificação pós-traducionais durante a maturação da hSOD1 catalisada pela hCCS. Experimentos de associação proteína-membrana utilizando diferentes combinações de mutantes de hCCS e SOD1 sugeriram que a aquisição de cobre ocorre via hCCS, em seu estado homodimérico, interagindo com a bicamada lipídica e, subsequentemente formando heterodímeros com hSOD1 fora da membrana. Adicionalmente, utilizando diferentes combinações de mutantes de hCCS e hSOD1 monitoramos a estabilidade dos heterocomplexos ao longo do tempo. Os resultados confirmaram a hipótese de que a formação da ligação dissulfeto é o último passo do processo de maturação do hSOD1 e o regulador da formação do complexo com hCCS. Com base nisso, um conjunto de complexos foi escolhido para os ensaios de cristalização. Os cristais para os heterodímeros foram obtidos usando kits de cristalização comerciais e otimizados usando diferentes técnicas. As estruturas dos heterocomplexos foram obtidas em diferentes estados de metalação para a hSOD1. Nossos resultados mostraram uma nova conformação para o subloop dissulfeto da hSOD1 responsável por regular a formação e dissociação do complexo, comunicar a presença de hCCS ao sítio ativo de hSOD1 e coordenar a dinâmica das mudanças pós traducionais de modo que a transferência de cobre anteceda a formação da ligação de dissulfeto, minimizando a produção de espécies hSOD1 potencialmente tóxicas. Uma vez que a ponte dissulfeto é formada, o heterodímero se dissocia pela presença do grupo metil da hCCS Ala231 que causa repulsão estérica na interface do complexo. Como consequência, a hSOD1 (com o íon cobre e a ligação dissulfeto oxidada) dimeriza para mitigar essa repulsão e, assim, gera as espécies homodiméricas maduras e cataliticamente ativas.
Titre en anglais
Protein-protein interactions involved in copper homeostasis, oxidative aging and neurodegenerative disease
Mots-clés en anglais
ALS, protein crystallography
hCCS
heterodimer
hSOD1
post-translational modifications
Resumé en anglais
Despite knowledge of human Cu,Zn Superoxide dismutase (hSOD1) importance in many cellular processes, the final stages of hCCS (human copper chaperone for Superoxide dismutase 1) dependent hSOD1 maturation, have never been fully elucidated. This process involves both copper transfer to hSOD1 and disulfide oxidation and understanding it can be critical in the fight against neurodegenerative diseases, as immature forms of SOD1 are typically identified as more prone to aggregation. The main difficulties are in obtaining the transient human heterocomplexes and the behaviour of full length hCCS which is recalcitrant to crystallization due to its highly flexible structure. The objective of this work was to investigate the recognition processes and sequence of activation events during the maturation of hSOD1 catalyzed by hCCS. Protein-membrane association experiments on different combinations of hCCS and SOD1 mutants suggested that copper acquisition occurs via hCCS, in its homodimeric state, engaging with the lipid bilayer and subsequently forming heterodimers with hSOD1 off the membrane. Additionally, complex stability experiments on combinations of hCCS and hSOD1 mutants confirmed that disulphide formation seems to be both the last step in the hSOD1 maturation and the regulator of complex formation with hCCS. Based on this, we chose a set of complexes suitable for crystallographic assays. Heterodimer crystals were obtained using commercial screens and optimized using different techniques. Crystals of heterodimeric complexes which were either hSOD1 apo or holo for copper in complex with hCCS were obtained, processed and analyzed. The analysis of the structures of the heterodimeric complexes showed a novel conformation for the SOD1 disulphide sub-loop which regulates complex formation and dissociation, communicates the presence of hCCS to the hSOD1 active site and coordinates the timing of copper transfer prior to the disulphide bond formation, minimizing the production of potentially toxic hSOD1 species. Once the disulphide bridge is formed, we suggest that the hCCS Ala231 methyl dictates the heterodimer dissociation by steric effects at the interface. As a consequence, hSOD1 (in its copper loaded and disulphide oxidized form) dimerizes to mitigate this repulsion and thereby generates the mature and catalytically active homodimeric species.
 
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Date de Publication
2020-05-26
 
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