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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.75.2021.tde-04052021-145432
Document
Author
Full name
Pedro Henrique Jatai Batista
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Carlos, 2021
Supervisor
Committee
Leitão, Andrei (President)
Braga, Fernão Castro
Bellete, Barbara Sayuri
Forim, Moacir Rossi
Santos Neto, Álvaro José dos
Title in Portuguese
Análise do metabolismo e estabilidade de inibidores de cisteíno protease em amostras biológicas por meio de HPLC-UV-MS
Keywords in Portuguese
análise da farmacocinética
estabilidade química
metabolismo
permeabilidade
relação estrutura-propriedade (SPR)
Abstract in Portuguese
O estudo de substâncias bioativas é multifacetado e requer que diversos métodos sejam aplicados para identificar um candidato a fármaco. Para doenças negligenciadas como a de Chagas, alvos macromoleculares como a cruzaína são usados para a descoberta de inibidores. Dentre eles, dipeptidil nitrilas inibem a cruzaína e apresentam grande potencial terapêutico. No entanto, os parâmetros farmacocinéticos são de grande relevância e devem ser obtidos para estabelecer relações estrutura-propriedade (SPR) para a permeabilidade, o metabolismo e a estabilidade química. Neste trabalho, a validação do método analítico HPLC-UV de um inibidor sintetizado pelo grupo (Neq0570) é realizada usando o odanacatib como padrão interno, usando a legislação atual da ANVISA. O desenvolvimento do método analítico levou a um gradiente de 15 a 85% de acetonitrila em 14 min, vazão 1,0 mL.min-1, 35 oC, volume de injeção de 5 µL, detecção em 225 nm (Neq0570) e 265 nm (odanacatib). A técnica de preparo de amostras foi a extração líquido-líquido em 3 extrações sequenciais, utilizando o éter metil terc-butílico como solvente extrator na proporção de 1:1. O método apresentou boa linearidade na faixa de 10-70 ng.mL-1, não apresentou efeito de matriz e nem efeito residual, apresentou também seletividade e acurácia. O método foi capaz de quantificar o composto parental para as duas cepas diferentes, Y e Tulahuen, nos meios extracelular (23% e 22%, respectivamente) e intracelular (43% e 46%, respectivamente). Desta forma, entre 66 a 69% do composto parental estava presente no frasco de cultura após 3 dias de ensaio, o que demonstra uma boa estabilidade da substância. Os possíveis metabólitos foram propostos a partir da estrutura química do composto parental. Ao final, avaliou-se a reatividade intrínseca desta substância, e de outros derivados sintetizados pelo grupo, sendo que todos apresentaram boa estabilidade. Os resultados alcançados demonstram que Neq0570 é um composto matriz (lead) adequado para a continuação dos estudos de otimização química de derivados antichagásicos, considerando a gênese planejada de fármacos.
Title in English
Analysis of metabolism and stability of cysteine protease inhibitors in biological samples by hplc-uv-ms
Keywords in English
chemical stability
metabolism
permeability
pharmacokinetic analysis
structure-property relationship (SPR)
Abstract in English
The study of bioactive substances is multifaceted subject and requires the application of numerous methods to identify a new candidate. Neglected diseases, as Chagas, are being tackled by the discovery of inhibitors for macromolecular targets, including cruzain. Among these inhibitors, dipeptidyl nitriles promote the cruzain inhibition and present promising therapeutic potential. However, pharmacokinetic parameters must be accessed to determine structure-property relationships (SPR) for permeability, metabolism and chemical stability. Here, the HPLC-UV analytical method of an inhibitor synthesized by the group (Neq0570) is performed using odanacatib as an internal standard, based on the current ANVISA legislation. The analytical method development led to a gradient from 15 to 85% acetonitrile in 14 min, flow rate 1.0 mL.min-1, 35 oC, injection volume of 5 µL and detection at 225 nm and 265 nm for Neq0570 and odanacatib, respectively. The sample preparation technique was liquid liquid extraction in 3 sequential extractions, using MTBE as a solvent extractor in the proportion of 1: 1. The method showed good linearity in the 10-70 ng.mL-1 range, with no matrix or residual effects, besides showing selectivity and accuracy. The method was able to quantify the parent compound in two different strains, Y and Tulahuen, in extra and intra cellular media. It was also able to identify potential metabolites of the parent compound. Finally, the method allowed the evaluation of intrinsic reactivity for the Neq0570 and the other similar derivatives synthetized by our group.
 
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Publishing Date
2021-05-05
 
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