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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.75.2007.tde-29082007-111527
Documento
Autor
Nome completo
Celia Sulzbacher Caruso
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2007
Orientador
Banca examinadora
Carrilho, Emanuel (Presidente)
Borges, Julio Cesar
Costa, Maria Cristina Nonato
Porto, Andre Luiz Meleiro
Souza, Dulce Helena Ferreira de
Título em português
Clonagem, expressão e caracterização de proteinas recombinantes de Xylella fastidiosa
Palavras-chave em português
caracterização
clonagem
dicroismo circular
expressão
fluorescência"
pET28a
Xylella fastidiosa
Resumo em português
A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas caracterizações.
Título em inglês
Cloning, expression and characterization of Xylella fastidiosa proteins
Palavras-chave em inglês
characterization
circular dichroism
cloning
expression
fluorescence spectroscopy
pET28a
Xylella fastidiosa
Resumo em inglês
Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase, chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein. Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence spectroscopy.
 
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Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
CeliaCaruso.pdf (2.04 Mbytes)
Data de Publicação
2007-08-31
 
AVISO: O material descrito abaixo refere-se a trabalhos decorrentes desta tese ou dissertação. O conteúdo desses trabalhos é de inteira responsabilidade do autor da tese ou dissertação.
  • CARUSO, Célia Sulzbacher, et al. 'alfa'-hydroxynitrile lyase protein from Xylella fastidiosa : cloning, expression, and characterization [doi:10.1016/j.micpath.2009.06.007]. Microbial Pathogenesis [online], 2009, vol. 47, p. 118-127.
  • GARCIA, Wanius, et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a glutathione S-transferase from Xylella fastidiosa [doi:10.1107/s174430910706825x]. Acta Crystallographica. Series F [online], 2008, vol. 64, p. 85-87.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Cloning, expression, purification and characterization of recombinant Glutathione-S-Transferase from Xylella fastidiosa [doi:10.1016/j.pep.2008.01.017]. Protein Expression and Purification [online], 2008, vol. 59, p. 153-160.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Study of stability and structure of the Glutathione-S Transference Protein (GST) of Xylella fastidiosa. In Workshop on Biocalorimetry and Biological Thermodynamics, Rio de Janeiro, 2006. Abstract book., 2006. Resumo.
  • CARUSO, Célia Sulzbacher, et al. Cloning and expression of Tatd, an enzyme twin arginine translocation system from Xylella fastidiosa. In XXXIV Reuniao Anual da Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular, Aguas de Lindoia, 2005. Programas e Resumos., 2005. Abstract.
  • CARUSO, Célia Sulzbacher, et al. Cloning, Expression and Purification of Putative a-Hydroxynitrile Lyase Protein from Xylella fastidiosa. In XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular - SBBq, Águas de Lindóia, 2005. Livro de Resumos., 2005. Abstract.
  • HUACCA, Maribel Elizabeth Funes, et al. Expression analysis of an operon encoding alkaline protease, a serie protease in xylella fastidiosa using lab-on-chip technology. In IX Workshop da Pós-Graduação: A Contribuição do IQSC para a inovação e o Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, São Carlos, 2005. Livro de Resumos., 2005. Abstract.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Cloning and expression of TatD, an enzime twin arginine translocation system from Xylela fastidiosa. In 9º Workshop da Pós Graduação do IQSC, São Carlos, 2005. Livro de Resumos., 2005. Abstract.
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  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Expression analysis of an operon encoding alkaline protease, a serine protease in xylella fastidiosa using lab-on-chip technology. In XXXIV Reuniao Anual da Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular, Aguas de Lindoia, 2005. Programas e Resumos., 2005. Abstract.
  • TREVENZOLO, Regiane, et al. Comparative analysis of the determination of tat d protein from xylella fastidiosa using slab gel eletrophoresis and capillary electrophoresis in microchip format. In LACE 2005, Guaruja, 2005. Book of Abstracts., 2005. Abstract.
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