• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.75.2007.tde-29082007-111527
Document
Auteur
Nom complet
Celia Sulzbacher Caruso
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Carlos, 2007
Directeur
Jury
Carrilho, Emanuel (Président)
Borges, Julio Cesar
Costa, Maria Cristina Nonato
Porto, Andre Luiz Meleiro
Souza, Dulce Helena Ferreira de
Titre en portugais
Clonagem, expressão e caracterização de proteinas recombinantes de Xylella fastidiosa
Mots-clés en portugais
caracterização
clonagem
dicroismo circular
expressão
fluorescência"
pET28a
Xylella fastidiosa
Resumé en portugais
A bactéria Xylella fastidiosa (X. fastidiosa) é um patógeno de planta que causa a clorose variegada dos citros, também conhecida como amarelinho. Xylella fastidiosa é uma bactéria limitada ao xilema, sendo transmitida de planta a planta através de insetos vetores. Através da determinação experimental da seqüência primária de algumas proteínas marcadamente expressas pela X. fastidiosa e a comparação destas com seqüências de ácidos nucléicos do genoma identificou entre elas três ORFs codificadoras de proteínas que podem estar relacionadas à patogenicidade desta bactéria no seu hospedeiro. No entanto, a função biológica destas proteínas ainda não foi funcionalmente caracterizada. Para investigar o papel biológico e realizar estudos de estrutura e função, as ORFs correspondentes as proteínas hidroxinitrila liase, corismato sintase e proteína D do sistema de transporte e secreção Tat foram clonadas, seqüenciadas e expressas em Escherichia coli. As proteínas recombinantes expressas foram purificadas por cromatografia de afinidade e suas identidades verificadas por seqüenciamento. As proteínas purificadas foram encontradas como uma única banda em SDS-PAGE. As proteínas recombinantes, pela primeira vez isoladas, foram caracterizadas em termos de estabilidade conformacional e comportamento estrutural frente a mudanças de pH e temperatura utilizando-se as espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência. O sucesso na construção do gene sintético e na clonagem em vetores de expressão de E. coli resultou em quantidade satisfatória de expressão das proteínas recombinantes. Duas delas apresentaram-se na formas solúveis, facilmente purificadas e ativas e permitindo suas caracterizações.
Titre en anglais
Cloning, expression and characterization of Xylella fastidiosa proteins
Mots-clés en anglais
characterization
circular dichroism
cloning
expression
fluorescence spectroscopy
pET28a
Xylella fastidiosa
Resumé en anglais
Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis, also known as "amarelinho". Xylella fastidiosa inhabits exclusively the xylem vessels, and is transmitted by sharpshooter vectors. The experimental determination of the primary sequence of some markedly expressed proteins for X. fastidiosa and the comparison with the nucleic acids sequence of its genome aided the identification of three of them as being proteins involved in host pathogenicity. However, the biological role of these proteins should be assigned experimentally. In order to investigate the biological role, function and structure, ORFs corresponding to hydroxynitrile liase, chorismate synthase and type V secretory pathway proteins were cloned, sequenced and expressed in Escherichia coli. The expressed recombinant proteins were purified by immobilized metal affinity chromatography (Ni-NTA resin) and their identities were verified by protein sequencing. The purified proteins were found as a single band on SDS-PAGE. The successful cloning and heterologous expression of recombinant HNL in E. coli resulted in a satisfactory amount of expressed protein. Two of the expressed recombinant proteins were soluble, easily purified, and isolated in an active form. X. fastidiosa recombinant proteins, for the first time isolated, were characterized according to enzyme conformational stability and structural behavior as a function of pH and temperature using circular dichroism and fluorescence spectroscopy.
 
AVERTISSEMENT - Regarde ce document est soumise à votre acceptation des conditions d'utilisation suivantes:
Ce document est uniquement à des fins privées pour la recherche et l'enseignement. Reproduction à des fins commerciales est interdite. Cette droits couvrent l'ensemble des données sur ce document ainsi que son contenu. Toute utilisation ou de copie de ce document, en totalité ou en partie, doit inclure le nom de l'auteur.
CeliaCaruso.pdf (2.04 Mbytes)
Date de Publication
2007-08-31
 
AVERTISSEMENT: Le matériau se réfère à des documents provenant de cette thèse ou mémoire. Le contenu de ces documents est la responsabilité de l'auteur de la thèse ou mémoire.
  • CARUSO, Célia Sulzbacher, et al. 'alfa'-hydroxynitrile lyase protein from Xylella fastidiosa : cloning, expression, and characterization [doi:10.1016/j.micpath.2009.06.007]. Microbial Pathogenesis [online], 2009, vol. 47, p. 118-127.
  • GARCIA, Wanius, et al. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of a glutathione S-transferase from Xylella fastidiosa [doi:10.1107/s174430910706825x]. Acta Crystallographica. Series F [online], 2008, vol. 64, p. 85-87.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Cloning, expression, purification and characterization of recombinant Glutathione-S-Transferase from Xylella fastidiosa [doi:10.1016/j.pep.2008.01.017]. Protein Expression and Purification [online], 2008, vol. 59, p. 153-160.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Study of stability and structure of the Glutathione-S Transference Protein (GST) of Xylella fastidiosa. In Workshop on Biocalorimetry and Biological Thermodynamics, Rio de Janeiro, 2006. Abstract book., 2006. Resumo.
  • CARUSO, Célia Sulzbacher, et al. Cloning and expression of Tatd, an enzyme twin arginine translocation system from Xylella fastidiosa. In XXXIV Reuniao Anual da Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular, Aguas de Lindoia, 2005. Programas e Resumos., 2005. Abstract.
  • CARUSO, Célia Sulzbacher, et al. Cloning, Expression and Purification of Putative a-Hydroxynitrile Lyase Protein from Xylella fastidiosa. In XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular - SBBq, Águas de Lindóia, 2005. Livro de Resumos., 2005. Abstract.
  • HUACCA, Maribel Elizabeth Funes, et al. Expression analysis of an operon encoding alkaline protease, a serie protease in xylella fastidiosa using lab-on-chip technology. In IX Workshop da Pós-Graduação: A Contribuição do IQSC para a inovação e o Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, São Carlos, 2005. Livro de Resumos., 2005. Abstract.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Cloning and expression of TatD, an enzime twin arginine translocation system from Xylela fastidiosa. In 9º Workshop da Pós Graduação do IQSC, São Carlos, 2005. Livro de Resumos., 2005. Abstract.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Cloning and Expression of TatD, an enzyme Twin Arginine translocation system from Xylella fastidiosa. In IX Workshop da Pós-Graduação: A Contribuição do IQSC para a inovação e o Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, São Carlos, SP, 2005. Livro de Resumos., 2005. Resumo.
  • TRAVENSOLO, R. F., et al. Expression analysis of an operon encoding alkaline protease, a serine protease in xylella fastidiosa using lab-on-chip technology. In XXXIV Reuniao Anual da Sociedade Brasileira de Bioquimica e Biologia Molecular, Aguas de Lindoia, 2005. Programas e Resumos., 2005. Abstract.
  • TREVENZOLO, Regiane, et al. Comparative analysis of the determination of tat d protein from xylella fastidiosa using slab gel eletrophoresis and capillary electrophoresis in microchip format. In LACE 2005, Guaruja, 2005. Book of Abstracts., 2005. Abstract.
Tous droits de la thèse/dissertation appartiennent aux auteurs
Centro de Informática de São Carlos
Bibliothèque Numérique de Thèses et Mémoires de l'USP. Copyright © 2001-2022. Tous droits réservés.