Exosomes (Exos), small extracellular vesicles, present in follicular fluid (FF), act in intercellular communication, carrying bioactive contents, such as mRNAs and lnc-RNAs, contributing to oocyte maturation. Hence, it is speculated that Exos present in the fluid of follicles containing good quality or poor quality oocytes are different in their RNA content. The first aim of this work was to comprehend, in detail, the relation between the content of polyadenylated RNAs of Exos originating from the FF and the oocyte/embryo development. To this end, the Exos from the FF were collected and isolated from 3 to 6 mm diameter follicles using a retrospective bovine model previously described. To track its competence, FF and oocyte were individually recovered through the dissection of follicles from randomly selected slaughterhouse`s ovaries. Gametes were matured, parthenogenetically activated and cultured individually for 7 days. Based on developmental records, oocytes and their respective follicular fluids were classified and separated in three groups, accordingly to developmental competence: NCLEAV Group (Incompetent Mature): Oocytes matured in vitro that did not cleave after parthenogenetic activation; CLEAV Group (Incompetent Cleaved): Oocytes cleaved after parthenogenetic activation that blocked the development at 3rd or 4th cell cycle; BLAST Group (Blastocysts): Oocytes that developed to the blastocyst stage. Differential gene expression, exclusive and HUB genes analyses of the transcriptomic data were performed, and transcriptional differences among the more competent (BLAST) and less competent (CLEAV and NCLEAV) groups (p-adjust.<0.1) were observed. Interestingly, several gene transcripts found significantly altered among these groups were related to signaling pathways associated with cell proliferation and meiosis modulation such as WNT, PI3K-Akt and Hippo signaling pathways. Due to its key function in all pathways, GSK3 (Glycogen Synthase Kinase 3) was selected as a candidate protein that potentially regulates these signaling pathways and the oocyte competence. To test this, oocytes were matured under 3 conditions: 1) CTL (control); 2) DKK1 treatment that indirectly stimulates GSK3β through DKK-1 (Dickkopf related protein 1) inhibition of the WNT signaling pathway; 3) CHIR treatment that directly inhibits GSK3β through the chemical probe CHIR99021. Polar body extrusion rates were observed, mature oocytes were parthenogenetically activated and in vitro cultured. The CHIR group presented a higher maturation rate compared with the others but no differences were observed in cleavage and Blastocyst development. To further understand the inhibition effect β-catenin was localized by immunocytochemistry and a increased nuclear localization was observed in CHIR group again. In conclusion the retrospective model identified crucial genes and pathways present in FF-derived Exos that are associated with oocyte competence. Modulation of GSK3β in COCs increased the extrusion rate of the 1st polar body while the other rates did not show statistical changes. However, the characteristics of the modification induced by GSK3β inhibition were similar to those observed in vivo in human oocytes.

Os exossomos (Exos), vesículas extracelulares pequenas, presentes no fluido folicular (FF), atuam na comunicação intercelular, transportando conteúdos bioativos, como mRNAs e lnc-RNAs, contribuindo para a maturação do ovócito. Assim sendo, especula-se que Exos presentes no fluido de folículos contendo oócitos de boa qualidade ou má qualidade são distintos no seu conteúdo de RNA. O primeiro objetivo deste trabalho foi compreender, detalhadamente, a relação entre o contéudo de RNAs poli-adenilados de Exos oriundos do FF, e o desenvolvimento oocitário e embrionário. Para tanto, Exos do FF foram coletados e isolados de folículos com diâmetro de 3 a 6 mm, utilizando um modelo retrospectivo bovino previamente descrito. Para rastrear sua competência, o FF e o ovócito foram recuperados individualmente através da dissecção de folículos oriundos ovários, selecionados aleatoriamente, de abatedouros. Os gametas foram maturados, ativados partenogeneticamente e cultivados individualmente por 7 dias. Com base nos registros de desenvolvimento, os ovócitos e seus respectivos fluidos foliculares foram classificados e separados em três grupos, de acordo com a competência de desenvolvimento: Grupo NCLEAV (Incompetente Maduro): Ovócitos maduros in vitro que não se dividiram após a ativação partenogenética; Grupo CLEAV (Incompetente Clivado): Ovócitos que se dividiram após a ativação, mas bloquearam o desenvolvimento no 3º ou 4º ciclo celular; Grupo BLAST (Blastocistos): oócitos que se desenvolveram até o estágio de blastocisto. Foram realizadas análises de expressão gênica diferencial, genes exclusivos e genes centrais a partir dos dados transcriptômicos, e diferenças transcricionais entre os grupos mais competentes (BLAST) e menos competentes (CLEAV e NCLEAV) (p-ajust.<0.1) foram observadas. Interessantemente, vários transcritos gênicos encontrados significativamente alterados entre esses grupos estavam relacionados a vias de sinalização associadas à proliferação celular e modulação da meiose, como as vias de sinalização WNT, PI3K-Akt e Hippo. Devido à sua função fundamental em todas essas vias, a GSK3 (Glicogênio Sintase Quinase 3) foi selecionada como proteína candidata que potencialmente regula essas vias de sinalização e a competência do ovócito. Para testar isso, os ovócitos foram maturados sob três condições: 1) CTL (controle); 2) Tratamento com DKK1, que estimula indiretamente a GSK3β através da inibição da via de sinalização WNT pelo DKK-1 (proteína relacionada ao Dickkopf 1); 3) Tratamento com CHIR, que inibe diretamente a GSK3β através da sonda química CHIR99021. Foram observadas taxas de extrusão de corpúsculo polar, e os ovócitos maduros foram ativados partenogeneticamente e cultivados in vitro. O grupo CHIR apresentou uma maior taxa de maturação em comparação com as outras, mas não foram observadas diferenças na clivagem e no desenvolvimento a blastocisto. Para melhor compreender o efeito de inibição, a β-catenina foi localizada por imunocitoquímica, e uma maior localização nuclear foi observada novamente no grupo CHIR. Em conclusão, o modelo retrospectivo identificou genes e vias presentes em Exos derivados de FF que estão associadas à competência do oócito. A modulação da GSK3β nos COCs aumentou a taxa de extrusão do 1º corpúsculo polar enquanto as demais taxas não apresentaram alterações estatísticas. Contudo, as características da modificação induzida pela inibição da GSK3β foram semelhantes às observadas in vivo em ovócitos humanos.