Os tumores mamários constituem cerca de 50% das neoplasias em cadelas e mesmo os indicadores prognósticos convencionalmente aceitos, não conseguem prever adequadamente o comportamento clínico destes tumores. Esse fato destaca a necessidade de identificar marcadores prognósticos mais eficazes. As proteínas da família LOX desempenham um papel na progressão do câncer, associando-se à invasão tumoral, metástases e prognósticos desfavoráveis em vários tipos de tumores. HIF1A possui relação com a agressividade, progressão e resistência à terapia do câncer de mama e controla as vias de expressão das Lisil oxidases. Os objetivos dessa pesquisa foram caracterizar a expressão imuno-histoquímica das proteínas LOX, LOXL2 e HIF1A em amostras de neoplasias mamárias de cadelas com o intuito de avaliação prognóstica e investigar os efeitos da hipóxia nas expressões de LOX e HIF1A em linhagens celulares de carcinomas mamários humanos e caninos, bem como seu efeito na migração e proliferação celulares. Foram analisadas 95 amostras de carcinomas mamários de 91 cadelas com acompanhamento clínico mínimo de 180 dias. As amostras de tumores foram submetidas à imuno-histoquímica para detecção de LOX, LOXL2 e HIF1A. As reações foram quantificadas em cinco imagens à objetiva de 40x obtidas em campos aleatórios e em campos de alta marcação. Os resultados foram comparados aos tipos histológicos, mortalidade decorrente da doença e tempo de sobrevida pós-cirúrgica. Para os testes in vitro, foram utilizadas uma linhagem celular de adenocarcinoma mamário humano (MDA-MB-231), uma canina (CIPp), e uma linhagem metastática de carcinoma sólido de cão (CIPm). A hipóxia foi simulada mediante a aplicação de dicloreto de cobalto (CoCl₂) e glicose oxidase/catalase. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significantes para LOX, LOXL2 e HIF1A entre os grupos histológicos de Alta e Baixa Malignidade, quando comparadas a presença/ausência de marcação em células epiteliais, a porcentagem de células epiteliais marcadas e a intensidade de marcação. Todos os casos analisados no grupo de animais censurados apresentaram marcação para a proteína LOXL2 em células epiteliais, enquanto 33,3% dos casos em que o óbito foi decorrente do tumor foram negativos. Apenas 12,5% dos tumores de Alta Malignidade apresentaram fibroblastos positivos para HIF1A, contra 61,4% dos de Baixa Malignidade (p=0,0180). Nas primeiras 24 horas de hipóxia, apenas a linhagem CIPm não apresentou redução significativa da proliferação e 8 horas após o tratamento, a migração das células tratadas com 100 µM de CoCl₂ mostrou um aumento significativo na migração em comparação com o grupo controle. Nossos resultados sugerem que a menor expressão de HIF1A em fibroblastos intratumorais e menor expressão de LOXL2 são indicadores de maior chance de morte em decorrência de carcinomas mamários. A hipóxia induzida por CoCl₂ desencadeia redução significativa na proliferação celular inicial e, sob condições hipóxicas, células de linhagens metastáticas aumentam sua atividade migratória.

Mammary tumors account for about 50% of neoplasms in female dogs, and even the conventionally accepted prognosis indicators cannot adequately predict the clinical behavior of these tumors. This fact highlights the need to identify more effective prognostic markers. The LOX family proteins play a role in cancer progression, associated with tumor invasion, metastasis, and unfavorable prognosis in various tumor types. HIF1A is related to aggressiveness, progression, and resistance to breast cancer therapy and controls the expression pathways of Lysyl oxidases. The objectives of this research were to characterize the immunohistochemical expression of the LOX, LOXL2, and HIF1A proteins in mammary neoplasms of bitches for prognostic evaluation, and to investigate the effects of hypoxia on the expressions of LOX and HIF1A in human and canine mammary carcinoma cell lines, as well as the effect of these proteins on cell migration and proliferation. Ninety-five samples of mammary carcinomas from 91 female dogs with a minimum clinical follow-up of 180 days were analyzed. Tumor samples were subjected to immunohistochemistry for the detection of LOX, LOXL2, and HIF1A. The reactions were quantified in five images using a 40x objective, obtained at random fields or hot spots. The results were compared with histological types, mortality due to the disease, and post-surgical survival time. For in vitro experiments, a human and a canine mammary adenocarcinoma cell lines (MDA-MB-231 and CIPp, respectively), and a metastatic cell line derived from a solid carcinoma from a dog (CIPm) were used. Hypoxia was simulated by applying cobalt dichloride (CoCl₂) and glucose oxidase/catalase. No statistically significant differences were found for LOX, LOXL2, and HIF1A between the High and Low Malignancy histological groups when comparing the presence/absence of labeling in epithelial cells, the percentage of labeled epithelial cells, and the intensity of labeling. All censored cases in the survival analysis were positive for LOXL2 in epithelial cells, while 33.3% of the dogs that died due to the tumor were negative. Only 12.5% of High Malignancy tumors had positive fibroblasts for HIF1A, compared to 61.4% of Low Malignancy group (p=0.0180). In the first 24 hours of hypoxia, the CIPm lineage did not show significant reduction in proliferation and, 8 hours after treatment, cells treated with 100 µM of CoCl₂ showed a significant increase in migration compared with the control group. Our results suggest that lower HIF1A expression in intratumoral fibroblasts and lower LOXL2 expression are indicators of a higher chance of death due to mammary carcinomas. CoCl₂-induced hypoxia triggers a significant reduction in cell proliferation and, under hypoxic conditions, CIPm cells increase their migratory activity.