A maturação in vitro (MIV) é a etapa mais delicada no sistema de produção in vitro de embriões (PIVE), pois ainda existem grandes limitações em mimetizar in vitro condições que sejam similares às que são encontradas dentro do folículo. Fisiologicamente, a comunicação entre células foliculares e gameta é essencial para que se propague os sinais hormonais que culminam com a maturação e aquisição da competência oocitária ao desenvolvimento. Entretanto, essa comunicação é obstruída precocemente quando se retira o complexo cumulus-oócito do ambiente folicular para submetê-lo ao sistema in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes sistemas de MIV sobre a progressão meiótica, a comunicação entre cumulus e oócito e a modulação da expressão gênica, parâmetros que conferem qualidade ao gameta. Para isso, foram realizados dois estudos. No Estudo 1, intitulado Os sistemas de pré-maturação com CNP e de maturação in vitro modificada modulam a progressão meiótica e a comunicação entre cumulus e oócito em bovinos, foram analisados oócitos e células do cumulus imaturos versus pré-maturados com o precursor do peptídeo natriurético tipo C (CNP) e hormônios esteróides, e durante a MIV em meio de maturação convencional, ou em meio modificado com suplementação de ampirregulina (AREG), IGF1, estradiol e progesterona, precedidos ou não pela pré-maturação. Nesse estudo foram avaliados a eficiência de manutenção do bloqueio meiótico pelo CNP, os efeitos dos diferentes sistemas de MIV sobre: a manutenção das comunicações entre oócito e cumulus, avaliada através da densidade de projeções transzonais íntegras (TZPs); a expansão das células do cumulus durante a MIV; as taxas de maturação; e expressão de genes relacionados a esses mecanismos. A adição da etapa de pré-MIV com CNP promoveu uma alteração na cinética de maturação, resultando em menor taxa de MII às 19h de MIV, porém com cerca de 24% dos oócitos atingindo o estágio de MII às 9h de MIV. A pré-MIV foi eficiente para manter cerca de 80% dos oócitos em bloqueio meiótico, porém promoveu uma redistribuição da frequência dos estágios de GV na população pré-maturada em comparação com oócitos imaturos, com uma diminuição na frequência de oócitos em GV2 e aumento de GV1 e GV3, além de apresentar cerca de 20% de GVBD ao final das 9h do protocolo. Dessa população pré-maturada enriquecida por GV1, cerca de 15% manteve atividade transcricional durante as últimas 4h de protocolo. Além disso, a pré-MIV promoveu uma diminuição na densidade de TZPs íntegras comparado com o grupo imaturo, e em pré-maturados GV3 comparados com pré-maturados GV1. Às 9h de MIV, o meio modificado promoveu menores densidades de TZPs em comparação com os grupos controles imaturo e da MIV. Pré-MIV e MIV modificada aumentaram os níveis de expressão de ERK2 e PRKACA em células do cumulus, comparados com os grupos controle. As taxas de expansão do cumulus e os níveis de expressão de HAS2 e TNFAIP6 foram menores, e os níveis de PTX3 maiores nos grupos maturados em MIV modificada, comparados com a MIV controle. Os resultados deste estudo mostraram que a eficiência dos protocolos propostos é influenciada pelo estágio de desenvolvimento do oócito que é submetido ao respectivo sistema, e que diferenças sutis nesse parâmetro podem determinar respostas distintas in vitro. No Estudo 2, intitulado Os sistemas de pré-maturação com CNP e de maturação in vitro modificada modulam a expressão de genes associados aos mecanismos de tradução e degradação de RNAm no COC bovino, o experimento inicial consistiu em avaliar, em oócitos imaturos, maturados in vivo e maturados in vitro, os níveis de expressão de quatro genes, sendo dois ligados ao processo de tradução (CPEB1 e CPEB4), e dois associados à degradação de RNAm (CNOT7 e ZFP36L2). A expressão de ZFP36L2 foi diminuída pelo sistema de MIV. A partir desse resultado, foram selecionados genes associados às maquinarias de tradução e degradação de RNAm para serem analisados, por RT-qPCR, em células do cumulus e oócitos dos mesmos grupos experimentais do Estudo 1. Os resultados desse estudo mostraram que tanto a pré-MIV quanto a MIV modificada induziram aumentos na expressão de diversos genes dessas vias em células do cumulus. Nos oócitos, os efeitos desses sistemas na expressão gênica foram sutis, e ao contrário da hipótese inicial, a MIV modificada induziu quedas nos níveis de ZFP36L2, tanto em RNAm quanto em proteína, porém com pouco impacto sobre os níveis de seus transcritos-alvo. Esses resultados mostraram que embora o oócito seja menos susceptível aos efeitos do sistema de MIV sobre a modulação de transcritos maternos, as células do cumulus podem ser afetadas e moduladas com o intuito de incrementar a competência do gameta. Conjuntamente, esse trabalho ajuda a elucidar de forma mais detalhada como características intrínsecas do COC podem afetar os resultados dos sistemas de MIV.

In vitro maturation (IVM) is the most fragile stage in in vitro embryo production (IVP), since there are still significant limitations in mimicking in vivo conditions on in vitro environment. Physiologically, the intrafollicular communication is essential to propagate the hormonal signaling that results in oocyte maturation and acquisition of developmental competence. However, this communication is prematurely disrupted when cumulus-oocyte complexes are removed from the follicle for in vitro processing. The aim of this study was to evaluate the effect of different in vitro maturation systems on meiotic progression, cumulus-oocyte communication, and gene expression modulations, parameters associated to oocyte quality. For this, two studies were conducted. In Study 1, entitled Prematuration with CNP and modified in vitro maturation systems modulate meiotic progression and cumulus-oocyte communication in cattle, immature oocytes and cumulus cells were analyzed in comparison to COCs pre-matured with natriuretic peptide type C precursor (CNP) and steroid hormones, and during IVM in conventional maturation medium, or in modified medium with supplementation of ampyregulin (AREG), IGF1, estradiol and progesterone, preceded or not by pre-IVM. In this study, the efficiency of maintaining meiotic block by CNP, the effects of the different IVM systems on the maintenance of communication between oocyte and cumulus, evaluated through the density of intact transzonal projections (TZPs), the expansion of cumulus cells during IVM, maturation rates and expression of genes related to these mechanisms were evaluated between groups. The addition of the pre-IMV step with CNP promoted a change in the maturation kinetics, resulting in a lower rate of MII at 19h IVM, but promoting around 24% of oocytes reaching MII stage at 9h IVM. Pre-IMV was efficient in maintaining around 80% of oocytes in meiotic block, however it promoted a redistribution of the frequency of GV stages in the pre-matured population compared to immature oocytes, with a decrease in the frequency of oocytes in GV2 and an increase of GV1 and GV3, in addition to showing around 20% of GVBD at the end of 9h of the protocol. From this enriched GV1 pre-matured population, approximately 15% maintained transcriptional activity during the last 4h of pre-IVM culture. Furthermore, pre-IMV promoted a decrease in intact TZP density compared with immature COCs, and also in pre-matured GV3 COCs compared with the GV1 counterparts. At 9h of IVM, the modified media promoted lower densities of TZPs compared to the immature and IVM control groups. Pre-IMV and modified IVM increased the expression levels of ERK2 and PRKACA in cumulus cells compared with control groups. Cumulus expansion rates, and HAS2 and TNFAIP6 expression levels were lower, and PTX3 levels were higher in groups matured in modified media, compared to control IVM. The results of this study showed that the efficiency of the proposed IVM systems are influenced by the stage of development of the oocyte that is submitted to the respective system, and that subtle differences in this parameter can determine different responses in vitro. In Study 2, entitled CNP pre-maturation and modified in vitro maturation systems modulate the expression of genes associated with the mechanisms of translation and mRNA degradation in bovine COC, the initial experiment consisted of evaluating in immature, in vivo and in vitro matured oocytes, the expression levels of four genes, two associated with translation process (CPEB1 and CPEB4), and two associated with mRNA degradation (CNOT7 and ZFP36L2). ZFP36L2 expression was decreased by the IVM system. From this result, genes associated with mRNA translation and degradation machineries were selected to be analyzed, by RT-qPCR, in cumulus cells and oocytes from the same experimental groups from Study 1. The results of this study showed that pre-IVM and modified IVM increased the expression of several of these genes in cumulus. In oocytes, the effect of these IVM system on gene expression was subtle, and contrary to the initial hypothesis, modified IVM induced decrease in ZFP36L2 levels, both in mRNA and protein, but with little impact on its target transcripts. These results show that although the oocyte had been less susceptible to the effects of the IVM system on the modulation of maternal transcripts, the cumulus cells can be affected and modulated with the aim of increasing the gamete's competence. Together, this work helps to elucidate in more detail how intrinsic characteristics of the COC can affect the results of IVM systems.