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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.74.2020.tde-06052021-153621
Documento
Autor
Nome completo
Pedro Luiz Porfirio Xavier
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Pirassununga, 2020
Orientador
Banca examinadora
Fukumasu, Heidge (Presidente)
Dagli, Maria Lucia Zaidan
Montenegro, Raquel Carvalho
Pereira, Tathiane Maistro Malta
Sangalli, Juliano Rodrigues
Título em inglês
Exploring epigenetic mechanisms to target mammary cancer cells: a comparative approach
Palavras-chave em inglês
BET proteins
Comparative oncology
Epigenetics
Histone deacetylases
Mammary cancer
Self-renewal
Tumorigenicity
Resumo em inglês
Cancer is one of the main causes of deaths in dogs worldwide, and mammary cancer in female dogs corresponding to more than 50% of all types of tumors. In addition, mammary tumors in dogs share many clinical and molecular similarities in comparison to breast cancer in women. Therefore, dogs are great models for comparative studies in oncology. Epigenetic mechanisms are key regulators of gene expression and dysregulation of these mechanisms are associated to the development of several types of cancer both in humans and dogs. Thus, canine model may be important for the development of innovative and potential therapies for cancer, especially for breast cancer. Thus, the main purposes of this thesis were: 1) to review the epigenetic mechanisms behind the development of different types of cancer in dogs, in comparison with abnormalities well described in human cancer; 2) to determine possible molecular targets associated with tumorigenicity and invasiveness in canine mammary cancer cells (CMC cells); 3) to determine potential epigenetic targets associated with self-renewal and tumorigenicity in CMC cells; 4) to observe the effects of a new dual BET/HDAC inhibitor in human breast cancer cells using 2D and 3D in vitro models. In the first chapter, we gathered findings demonstrating that some epigenetic abnormalities are similar in both human and canine cancer, suggesting a potential approach to use the canine model to determine new epigenetic mechanisms regulating cancer and to develop new therapies. In chapter 2, using in vitro models, we demonstrate that epithelial-mesenchymal (EMT)-associated transcription factors, ZEB1 and ZEB2, are associated with tumorigenicity and invasiveness of CMC cells, exhibiting higher expression in mesenchymal-like cells in comparison with epithelial-like cells. In addition, we observed that molecular pathways associated with EMT, invasiveness, and tumorigenicity, such as ECM organization and degradation, focal adhesion, TGF-β / BMP signaling, PI3K-AKT signaling, and WNT signaling are enriched to upregulated genes overexpressed in mesenchymal-like cells. Furthermore, this work was important to determine cell lines presenting higher tumorigenic potential in our cell bank. In chapter 3, we demonstrated that inhibition of a family of epigenetic reader proteins, known as BET proteins, by (+)-JQ1, is a promising strategy to suppress in vitro tumorigenicity and self-renewal of CMC cells. BET inhibition resulted in a decrease of tumorspheres formation in low-adherence plates and colony formation in soft-agar assay, classical models used to assess in vitro self-renewal and tumorigenicity. Furthermore, inhibition of BET proteins decreased expression of important genes associated with self-renewal pathways including WNT, NOTCH, Hedgehog and PI3K/AKT/mTOR. Besides that, BET inhibition decreased ZEB2 expression, a transcription factor important for the maintenance of self-renewal in CMC cells. Finally, in chapter 4, we observed that the dual BET/HDAC inhibitor, TW09, reduced cell viability and increased cell death in human breast cancer cells in comparison with individual inhibition of BET and HDAC proteins by (+)-JQ1 and CI994, respectively. In addition, TW09 reduced number of primary and secondary BC tumorspheres, suggesting effects regarding tumorigenicity and self-renewal potential of breast cancer cells. Thus, TW09 demonstrated good effects in these cells. We still intend to deeply study the effects of dual BET/HDAC inhibition by TW09 on breast cancer both in human and canine cells in order to confirm this strategy as a potential and innovative therapy for mammary cancer in both species. Finally, the results demonstrated in this thesis collaborate to the validation and discovery of important mechanisms behind mammary cancer and its phenotypes in dogs, besides highlight the canine model as a great model to perform comparative studies in oncology and search for new targets and therapies for cancer, since several of the mechanisms and effects observed in this model, corroborate those observed in human cancer cells.
Título em português
Explorando mecanismos epigenéticos contra células de câncer de mama: uma abordagem comparada
Palavras-chave em português
Auto-renovação
Câncer de mama
Deacetilases de histonas
Epigenética
Oncologia comparada
Proteínas BET
Tumorigenicidade
Resumo em português
O câncer é uma das principais causas de morte em cães no mundo e as neoplasias mamárias representam mais de 50% dos tumores diagnosticados em fêmeas. Além disso, as neoplasias mamárias apresentam uma série de similaridades clínicas e moleculares com o câncer de mama em mulheres, destacando-as como excelentes modelos para o estudo da oncologia comparada. Os mecanismos epigenéticos são responsáveis por regular a expressão gênica nas células e desregulações nesses mecanismos estão associadas ao desenvolvimento de diversos tipos de câncer tanto em humanos como em cães. Assim, a utilização do modelo canino pode ser importante para o desenvolvimento de potenciais terapias epigenéticas para o câncer, em específico para o câncer de mama. Assim, essa tese teve como principais objetivos: 1) revisar os mecanismos epigenéticos que estão por trás do desenvolvimento de diferentes tipos de câncer em cães, comparando-os com as anormalidades já bem descritas no câncer humano; 2) determinar possíveis alvos moleculares associados aos processos de tumorigenicidade e invasão de células de câncer de mama canino (Células CMC); 3) determinar potenciais alvos epigenéticos associados ao potencial de tumorigenicidade e auto-renovação de células de câncer de mama canino; 4) observar os efeitos de um novo inibidor duplo de proteínas epigenéticas BET e deacetilases de histonas (HDACs) em células de câncer de mama humano utilizando modelos in vitro 2D e 3D. No primeiro capítulo, reunimos uma série de informações demonstrando que algumas modificações epigenéticas são similares no câncer em humanos e caninos, sugerindo uma potencial abordagem utilizando o modelo canino para determinar novos mecanismos epigenéticos reguladores do câncer e para o desenvolvimento de novas terapias. No capítulo 2, utilizando modelos in vitro, demonstramos que os fatores de transcrição associados ao processo de transição epitéliomesenquimal (EMT), ZEB1 e ZEB2, estão associados ao potencial de tumorigenicidade e invasão de células CMC e são mais expressos em células CMC com fenótipo mesenquimal do que células CMC com fenótipo epitelial. Além disso, observamos que vias moleculares associadas aos processos de EMT, invasão e tumorigenicidade, como organização e degradação de matriz extracelular, adesão focal, sinalização de TGF-β/BMP, PI3K-AKT e WNT são enriquecidas em genes superexpressos nas células CMC com fenótipo mesenquimal. Além disso, esse trabalho foi importante para a determinação das linhagens com maior potencial tumorigênico no nosso banco de células para a utilização no capítulo 3. Já no capítulo 3, nós demonstramos que a inibição de uma família de proteínas "readers" epigenéticas, conhecidas como proteínas BET, pelo inibidor (+)-JQ1, é uma estratégia promissora para inibir os fenótipos de tumorigenicidade e autorenovação de células CMC, em modelos in vitro. A inibição das proteínas BET resultou em diminuição da formação de tumoresferas em placas de baixa aderência e de colônias no ensaio de ágar-mole, dois modelos in vitro utilizados para se estudar auto-renovação e tumorigenicidade. Além disso, inibição de proteínas BET resultou em diminuição da expressão de importantes genes associados a vias moleculares de auto-renovação como WNT, NOTCH, Hedgehog e PI3K/AKT/mTOR, e diminuiu a expressão de ZEB2, o qual demonstramos ser importante para o fenótipo de tumorigenicidade em células CMC no capítulo 2. Finalmente, no capítulo 4 determinamos que o inibidor duplo de proteínas BET/HDACs, TW09, reduziu a viabilidade celular e aumentou a morte celular em células de câncer de mama humano em comparação com as inibições individuais de proteínas BET e HDACs. Além disso, TW09 diminuiu a formação de tumoresferas primárias e secundárias demonstrando efeito sobre os potenciais de tumorigenicidade e autorenovação das células de câncer de mama. Sendo assim, TW09 demonstrou bons efeitos nessas células. Ainda pretendemos aprofundar ainda mais os estudos dos efeitos da inibição dupla de proteínas BET/HDACs por TW09 no câncer de mama, em células humanas e caninas, podendo confirmar essa estratégia como uma potencial terapia para o câncer de mama em ambas espécies. Por fim, os resultados demonstrados ao longo dos capítulos dessa tese colaboram para a confirmação e descoberta de mecanismos importantes para o desenvolvimento do câncer de mama em cães e seus fenótipos, além de ressaltarem o modelo canino como um bom modelo para o estudo da oncologia comparada e busca de novos alvos e terapias contra o câncer, já que vários dos mecanismos e efeitos observados nesse modelo, corroboram com aqueles vistos em células de câncer humano.
 
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Data de Publicação
2021-05-06
 
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