A produção in vitro de embriões (PIV) é uma técnica amplamente utilizada para melhorar os parâmetros reprodutivos em bovinos e humanos. No entanto, a PIV ainda apresenta algumas limitações, como menores taxas de blastocisto e prenhez em comparação com embriões produzidos in vivo. Além disso, os embriões obtidos através da PIV possuem alterações epigenéticas que podem afetar o estabelecimento da prenhez e da saúde pós-natal. In vitro, os embriões são cultivados em placas, que podem ser seis vezes mais rígidas do que o ambiente in vivo, o que causa diferentes estímulos externos que geram diferentes respostas biológicas intracelulares nesses embriões. Uma alternativa bem estabelecida por ser mais fisiológica são os cultivos tridimensionais (3D), que consistem na criação de um microambiente onde as células interagem melhor entre si e com o meio de cultivo. Esses cultivos podem ser produzidos de diferentes formas e materiais. As liquid marbles (LM), são um tipo de cultivo 3D que consiste na criação de um ambiente através de uma pequena gota de líquido encapsulada por partículas de uma sustância hidrofóbica. Outro material constantemente utilizado é o alginato, que possui a capacidade de gerar um hidrogel estável a partir da adição de um íon bivalente. Baseado nisso, a nossa hipótese é que os sistemas 3D por LM ou hidrogéis de alginato possam contribuir positivamente durante as etapas de maturação e cultivo dos embriões produzidos in vitro. Para isso, no experimento 1 (capítulo 2), a maturação in vitro (MIV) foi realizada no sistema de LM e quando avaliada a taxa de maturação nuclear observamos que foi semelhante à do cultivo convencional. Contudo, a expansão das células do cumulus e a expressão de genes importantes para o processo de maturação dos oócitos nas células do cumulus foram diminuídos no grupo LM. O cultivo de prováveis zigotos também foi realizado no sistema LM. No dia 7, foi observada uma menor taxa de blastocisto, diminuição na expressão do bta-miR-615 e aumento na metilação e hidroximetilação global de DNA nos blastocistos do grupo LM. No experimento 2 (capítulo 3), o sistema de cultivo 3D por hidrogéis de alginato foi utilizado no cultivo de prováveis zigotos. Neste experimento, o cultivo convencional foi denominado 2D; uma superfície de hidrogel de alginato foi o grupo 2.5D; e o grupo 3D foi aquele em que os embriões foram encapsulados nos hidrogéis de alginato. No dia 7 do cultivo, foi observado uma diminuição na taxa de blastocisto em ambos os grupos 2.5D e 3D em comparação ao controle. Também houve uma diminuição da expressão dos miRNAs miR-1245 e miR-1260b no grupo 2.5D em relação aos demais. Além disso, o miR-541 foi menos expresso nos blastocistos do grupo 3D em relação ao 2D e 2.5D. Os padrões de metilação e hidroximetilação foram aumentados apenas nos embriões do grupo 2.5D. Além disso, também foi observado uma mudança no perfil transcricional global dos blastocistos cultivados em 2.5D e 3D quando comparados com o grupo 2D, em que genes importantes para o desenvolvimento embrionário inicial foram diferentemente expressos entre os embriões dos diferentes grupos. Juntos, estes resultados sugerem que os cultivos 3D utilizados nos nossos experimentos tiveram um impacto negativo na taxa de produção de embriões bovinos. Entretanto, mais estudos são necessários, visto que, para obtenção dos resultados de embriões produzidos in vitro que temos atualmente foram necessários mais de 40 anos de estudo e essa técnica continua sendo constantemente aprimorada. Portanto, em pesquisas futuras precisamos considerar a hipótese de que com a utilização do cultivo 3D será possível obter blastocistos de PIV semelhantes aos produzidos in vivo.

The in vitro embryo production (IVP) is a technique widely used to improve the reproductive parameters in bovines and humans. However, the IVP still have some limitations, such as lower blastocysts and pregnancies rates in comparison with the in vivo produced embryos. Moreover, the embryos produced by IVP harbor epigenetic alterations which can affect the conception rates and the health of the offspring. IVP embryos are cultured in petri dishes, that are ~6 x more rigid than the in vivo environment, causing different external stimuli and generating different intracellular responses in the embryos. An alternative to circumvent this and create a more physiological culture environment is to use the 3D cultures, which consists in the creation of a microenvironment where the cells can interact themselves and with the culture medium. These culture systems can be produced using several methodologies and materials. The Liquid Marbles (LM) are a type of 3D culture that consists in the creation of an environment trapping a small droplet of culture medium using a hydrophobic substance. An alternative material used is the alginate, that possess the capacity to generate a stable hydrogel after the addition of a bivalent ion. On this basis, our hypothesis was that the 3D systems produced using LM or alginate hydrogels can benefit the in vitro maturation and in vitro culture of bovine oocytes and embryos, respectively. To this end, in the experiment 1 (chapter 2), the in vitro maturation was carried out in LM. We observed that the nuclear maturation rate was similar between the LM and control group. However, the cumulus cells expansion and the expression of genes involved in the maturation processes were decreased in the LM group. The culture of presumptive zygotes was also carried out in LM. As a result, on the day 7 was observed lower blastocysts rate, decrease in the expression of the miRNA bta-miR-615 and increased in the global levels of DNA methylation and hydroxymethylation in the LM blastocysts compared with the controls. In the experiment 2 (chapter 3), the 3D system using alginate hydrogels were used to culture the embryos. In this experiment, the conventional culture was termed 2D; the embryo culture on top of an overlay of alginate termed 2.5D; and the culture with the embryos encapsulated in an alginate hydrogel termed 3D. After the culture for 7 days in each system, the blastocysts rates were examined. We observed a decrease in the blastocysts rates in the embryos cultured in the 2.5 and 3 D systems compared to the control. Regarding the miRNas expression, the miRNAs miR-1245 and miR-1260b were decreased in the 2.5D group compared with the other groups. Moreover, the miR-541 presented lower expression in the 3D group when compared with the other groups. The global levels of DNA methylation and hydroxymethylation increased only in the embryos from the 2.5D group. In addition, the transcriptome from embryos from the 2.5D and 3D differed from the control group, and are more similar between them. Also, several genes critical for embryo development, pluripotency, placentation were decreased in the embryos cultured in the alginate hydrogel. Altogether, these results suggest that the 3D culture systems used in our experiments impaired the embryo development. However, more studies are necessary to fully understand the effects caused by these molecules on embryos. The IVP technique has constantly evolved in the past 40 years, and always a new approach was attempted a lot of drawbacks had to be surpassed. In the future, we envision that the embryos will be cultured in more physiological systems and they will be more similar to the in vivo ones.