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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.74.2019.tde-12042021-123249
Documento
Autor
Nombre completo
Thaís Camilo Corrêa
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Pirassununga, 2019
Director
Tribunal
Sousa, Ricardo Luiz Moro de (Presidente)
Carriero, Mateus Maldonado
Keid, Lara Borges
Montassier, Hélio José
Monzani, Paulo Sérgio
Mostério, Cláudia Maris Ferreira
Título en portugués
Imunobiológicos para o diagnóstico laboratorial de ranavirose: clonagem e expressão do gene MCP de isolado brasileiro de Ranavirus e produção de anticorpos policlonais anti-proteína MCP recombinante
Palabras clave en portugués
Iridovirus
ELISA-IB
FV3
Imunorreagentes
Proteína recombinante
Resumen en portugués
Membros do gênero Ranavirus, pertencente à família Iridoviridae, têm sido responsáveis por epizootias em animais ectotérmicos em várias partes do mundo, pois representam patógenos emergentes capazes de infectar três classes de vertebrados: peixes ósseos, anfíbios e répteis. No Brasil, os relatos de surtos por ranavirose sassociados ao Frogvirus3 (FV3) ocorrem desde meados dos anos 2000, sendo cada vez mais frequentes principalmente em criações comerciais de rã-touro. Portanto, as infecções por ranavírus representam um risco para outros setores da aquicultura, como a piscicultura. Neste contexto, visando a produção de imunorreagentes para uso em testes de diagnóstico, os objetivos foram: produzir a proteína recombinante do gene MCP (Major capsid protein) do isolado brasileiro deRanavirus,FV3-símile; produzir anticorpos policlonais de coelho anti-rMCP e, por fim, padronizar um teste de ELISA-IB (Indirect-Blocking Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Para isso, foi construído o plasmídeo pET28a/MCP, transformado em Rosetta (™) (DE3) para a expressão da proteína rMCP. Após a purificação, a produção de anticorpos policlonais anti-rMCPfoi conduzida em dois coelhos jovens através de três inoculações da proteína rMCP, por via intramuscular e subcutânea, em intervalos de 14 dias, sendo os soros analisados por Immunoblot. Para a padronização do teste ELISA-IB, foram amostrados soros de rãs-touro e realizada a infecção experimental de tilápias do Nilo, para a obtenção de soros controles. Destaque para os resultados com o sucesso da expressão da proteína rMCP de 50kDa,no entanto, em sua forma insolúvel sob purificação desnaturante seguida de diálise. A rMCP desencadeou a produção de anticorpos policlonais nos coelhos, já na segunda imunização. No ELISA-IB, a proteína rMCP foi utilizada como antígeno viral, seguida dos soros testes e anticorpos de bloqueio (policlonal anti-rMCP). Contudo, problemas com a obtenção de soros controles adequados dificultaram a padronização do teste, sendo possível, no entanto, identificar porcentagem de inibição em soro de rã. O uso dos imunorreagentes produzidos e o ELISA-IB demostraram potencial promissor para o diagnóstico laboratorial de infecção por ranavírus em peixes, bem como anfíbios, no intuito de colaborar para a melhoria das condições sanitárias da aquicultura brasileira. Além disso, os imunorreagentes obtidos podem propiciar novos estudos para a produção de imunógenos vacinais contra o Ranavirus.
Título en inglés
Immunobiologics for the laboratory diagnosis of ranaviral infections: cloning and expression of the MCP gene from a Ranavirus Brazilian isolate and production of polyclonal antibodies against recombinant MCP protein
Palabras clave en inglés
Iridovirus
ELISA-IB
FV3
Immunoreagents
Recombinant protein
Resumen en inglés
Members of the genus Ranavirus, belonging to the family Iridoviridae, have been responsible for epizootics in ectothermic animals in various parts of the world, as they represent emerging pathogens capable of infecting three classes of vertebrates: bony fish, amphibians and reptiles. In Brazil, reports of Frog virus 3 (FV3)-associated ranavirus outbreaks have occurred since the mid-2000s, and are increasingly common mainly in commercial bullfrog farming. Therefore, ranavirus infections pose a risk to other aquaculture sectors, such as fish farming. In this context, aiming at the production of immunoreagents for use in diagnostic tests, the objectives were: to produce the recombinant MCP (Major capsid protein) gene from the Brazilian Ranavirus isolate, FV3-like; produce rabbit anti-rMCP polyclonal antibodies and, finally, standardize an ELISA-IB (Indirect-Blocking Enzyme Linked Immunosorbent Assay) test. To this end, the Rosetta (™)transformed plasmid pET28a / MCP (DE3) was constructed for the expression of the rMCP protein. Following purification, the production of polyclonal anti-rMCP antibodies was conducted in two young rabbits by three intramuscular and subcutaneous immunizations with the rMCP protein at 14-day intervals and the sera analyzed by Immunoblot. For standardization of the ELISA-IB test, bullfrog sera were sampled and experimental infection of Nile tilapia was carried out to obtain control sera. It is worth mentioning for the results, the successful expression of the 50kDa rMCP protein, however, in its insoluble form, under denaturing purification followed by dialysis. The rMCP triggered the production of polyclonal antibodies in rabbits as early as the second immunization. In ELISA-IB, rMCP protein was used as viral antigen, followed by sera tests and blocking antibodies (anti-rMCP polyclonal). However, problems with obtaining adequate control sera made the standardization of the test difficult, but it was possible to identify inhibition percentage in frog serum. The use of the produced immunoreagents and the ELISA-IB show promising potential for laboratory diagnosis of ranavirus infection in fish, as well as amphibians, in order to contribute to the improvement of sanitary conditions in Brazilian aquaculture. In addition, the obtained immunoreagents may provide further studies for the production of vaccine immunogens against Ranavirus.
 
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Fecha de Publicación
2021-04-12
 
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