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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.64.2013.tde-04092013-140620
Documento
Autor
Nome completo
Luciana Regina Mangeti Barreto Mourão
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Piracicaba, 2013
Orientador
Banca examinadora
Alencar, Severino Matias de (Presidente)
Silva, Bruno Bueno
Ikegaki, Masaharu
Louvandini, Helder
Melo, Mariza Pires de
Título em português
Estudo in vivo da atividade antioxidante da própolis vermelha brasileira
Palavras-chave em português
Acetaminofen
Atividade antioxidante in vivo
Estresse oxidativo
Própolis vermelha
Resumo em português
Dentre os produtos naturais que contém compostos secundários com atividade biológica, está a própolis, uma resina coletada por abelhas Apis mellifera de diversas partes da planta com atividades biológicas tais como, antimicrobiana, antiinflamatória, cicatrizante, anestésica, antiviral e antioxidante. Um tipo diferente de própolis e com perfil químico peculiar, foi denominada de própolis vermelha, a qual possui alto teor de compostos fenólicos, principalmente da classe dos isoflavonoides. De acordo com a literatura, esta própolis possui alta atividade antioxidante in vitro, porém estudos sobre o efeito antioxidante in vivo ainda não são conhecidos. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade antioxidante in vivo do extrato etanólico da própolis vermelha brasileira (EEP) por modelo de experimentação animal, assim como comparar o desempenho in vivo do EEP com antioxidantes de alta atividade e efetividade em sistemas biológicos. Para certificação do alto potencial antioxidante da própolis vermelha utilizada, conforme relatado na literatura , o EEP foi caracterizado quanto ao seu potencial antioxidante por várias metodologias in vitro, além de análises da composição química das substâncias não voláteis e voláteis. A avaliação do perfil químico do EEP incluiu análises como espectrofotometria na região ultravioleta visível, teor de compostos fenólicos totais, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de massas (CG-EM) e CG/EM-Headspace. Para as análises da atividade antioxidante in vitro foram utilizadas as metodologias de CLAE on-line, sequestro do radical ABTSo+; poder de redução do ferro (FRAP) e capacidade de absorbância de radicais de oxigênio (ORAC). No ensaio de avaliação da atividade antioxidante in vivo foi utilizado um delineamento experimental com 50 ratos Wistar machos, divididos em 7 tratamentos: Controle Normal (CTL/N), Controle estressado (CTL-J/APAP), Ácido Ascórbico (AA-J/APAP), Quercetina (Q-J/APAP), Própolis na dose de 150mg/kg (P150-J/APAP), 300mg/kg (P300-J/APAP) e 600mg/kg (P600-J/APAP). Todos os animais, com exceção do grupo CTL/N, foram tratados por 15 dias com os antioxidantes via intragástrica, e, ao 16º dia foram estressados com 800mg/kg de acetaminofen (APAP), via intragástrica, submetidos a 12 horas de jejum e então anestesiados e sacrificados para retirada de sangue e fígado para as análises de função hepática (enzimas ALT, AST e 'gama'GT), atividade de sequestro de radical superóxido no plasma pela enzima Superóxido Dismutase (SOD), Western Blot para as enzimas SOD e CAT, análise ORAC de plasma e fígado e histopatologia do tecido hepático. O EEP apresentou alto teor de compostos fenólicos (266,8 mg/g) e a presença de isoflavonoides e pterocarpanos, tais como liquiritigenina, isoliquiritigenina, vestitol, neovestitol, formononetina, biochanina, medicarpina, 3,4-diidroxi-9-metoxipterocaroano e 3,8-diidroxi-9-metoxipterocarpano, os quais são peculiares da própolis vermelha. Além disto, foram encontradas altas concentrações das substâncias voláteis 'alfa'-cubebeno e germacreno D, as quais não são as substâncias majoritárias da própolis vermelha de outras regiões. O EEP também apresentou elevado potencial antioxidante in vitro, tendo o valor de 4,26 mmol/g equivalente de Fe++ para o FRAP, 4,84 e 19.779,7 mmol de trolox para o ABTS e o ORAC, respectivamente. O APAP na dose e via de administração utilizada não gerou um estresse intenso para ser detectável por meio de alguns intermediários de vias e/ou rotas que respondem ao alto potencial oxidante. Porém, e de acordo com os resultados dos ensaios in vivo, a concentração para uso como antioxidante contra o estresse oxidativo se situa entre 150 a 300mg/kg. Portanto, a própolis vermelha brasileira além de alto potencial antioxidante in vitro também apresenta potencial antioxidante benéfico in vivo
Título em inglês
In vivo antioxidant activity study of Brazilian Red Propolis
Palavras-chave em inglês
Acetaminophen
In vivo antioxidant activity
Oxidative stress
Propolis
Resumo em inglês
Propolis is one of the natural products containing secondary compounds with biological activity. Propolis is a resin collected by honeybees from various plant parts and has several biological activities such as antimicrobial, anti-inflammatory, healing, anesthetic, antioxidant and antiviral. The Brazilian red propolis is a different type of propolis with a peculiar chemical profile compared to other types of Brazilian propolis, containing a high content of phenolic compounds, especially isoflavones. The literature reports that this propolis has high in vitro antioxidant activity, but studies on the in vivo antioxidant effects are still scarce. Therefore, this study investigated the in vivo antioxidant activity of the ethanol extract of Brazilian propolis (EEP) using animal experiments model. We also compared the in vivo EEP performance with high antioxidant activity and effectiveness in biological systems. To evaluate the high antioxidant propolis potential, as reported in the literature, the EEP was characterized for its in vitro antioxidant potential in various methodologies, as well as in analyses of the chemical composition of volatile and non-volatile substances. The evaluation of EEP chemical analyses included visible spectrophotometry in the ultraviolet region, total phenolic content, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) and GC/MS-Headspace. For in vitro analyses of antioxidant activity, we used the online HPLC methods, sequestration of ABTSo+ radicals, Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) and Oxygen-Radical Absorbance Capacity (ORAC). To assess in vivo antioxidant activity, we used an experimental design with 50 male Wistar rats divided into 7 treatments: Normal Control (N/CTL), Stressed Control (CTL-J/APAP), Ascorbic Acid (AAJ/ APAP), Quercetin (QJ/APAP), Propolis at 150mg/kg (P150-J/APAP), 300mg/kg (P300-J/APAP) and 600mg/kg (P600-J/APAP). All animals, except for the N/CTL group, were treated for 15 days with intragastric antioxidants, and on the 16th day, they were stressed with 800mg/kg of acetaminophen (APAP), intragastrically. Afterwards, they underwent a 12-hour fast, then, anesthetized and sacrificed to collect blood and liver for analyses of liver function (ALT, AST and 'gama'GT enzymes), activity of superoxide radical sequestration in plasma by the enzyme Superoxide Dismutase (SOD), Western Blot for SOD and CAT enzymes, ORAC analysis of plasma and liver histopathology and liver tissue. The EEP showed high content of phenolic compounds (266.8 mg/g) and the presence of isoflavones and pterocarpans such as liquiritigenin, isoliquiritigenin, vestitol, neovestitol, formononetin, biochanin, medicarpin, 3,4-dihydroxy-9-methoxy pterocarn and 3,8-dihydroxy-9-methoxy pterocarpan, which are peculiar to the red propolis. Moreover, we found high concentrations of volatile 'alfa'-cubebeno and germacrene D, which are not the majority of substances in propolis from other regions. The EEP also showed high in vitro antioxidant activity, with 4.26 mmol/g equivalent of Fe++ for FRAP, 4.84 and 19779.7 mmol of trolox for ABTS and ORAC, respectively. The APAP in the dose and route of administration used did not generate intense stress detectable through some intermediate routes and/or routes that respond to the high oxidizing potential. However, according to the results of in vivo analysis, the concentration for use as an antioxidant against oxidative stress ranges from 150 to 300mg/kg. Therefore, the Brazilian red propolis has high in vitro antioxidant potential as well as beneficial in vivo antioxidant potential
 
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Data de Publicação
2013-09-12
 
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