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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.64.2015.tde-19052015-142119
Document
Author
Full name
Leonardo Soriano
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2015
Supervisor
Committee
Martinelli, Adriana Pinheiro (President)
Caldas, Danielle Gregorio Gomes
Boava, Leonardo Pires
Carrer, Helaine
Mourão Filho, Francisco de Assis Alves
Title in Portuguese
Organogênese in vitro e transformação genética de variedades de tangerina (Citrus reticulata Blanco e Citrus clementina hort. ex Tan.)
Keywords in Portuguese
Citricultura
Cultura de tecidos de plantas
Embriogênese somática
Expressão gênica
Genética molecular vegetal
Greening (Doença de planta)
Protoplastos
Abstract in Portuguese
Atualmente, o Huanglongbing (HLB), doença associada à bactéria Candidatus Liberibacter spp., é a principal ameaça dos Citrus, não tendo sido encontrado ainda espécies resistentes e tolerantes. O melhoramento genético tradicional apresenta limitações para a obtenção de novas variedades porta-enxerto e copa de citros em decorrência a fatores ligados à biologia do gênero. Na tentativa de sobrepor essas dificuldades, a transformação genética destaca-se por permitir a introdução de genes exógenos, os quais, além de reduzir o período de obtenção de material melhorado geneticamente, poderão conferir resistência a doenças em variedades de interesse agronômico. Desse modo, o objetivo desta pesquisa consistiu no estudo da organogênese in vitro, e na obtenção de plantas transgênicas via Agrobacterium tumefaciens das tangerinas 'Fremont', 'Thomas' e 'Nules', com o gene que codifica o peptídeo antibacteriano atacina A (attA), controlado pelos promotores AtSUC2 e AtPP2, visando a expressão gênica preferencial nos vasos do floema. Adicionalmente, foi avaliada a transformação genética via A. tumefaciens de suspensões celulares de tangerina 'W-Murcott', de laranja doce 'Hamlin' e de tangelo 'Page', e a transformação genética direta via PEG de protoplastos da tangerina 'W-Murcott', com os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby, dirigidos pelos promotores com expressão preferencial nos tecidos embrionários 6105 e DC3. A eficiência da organogênese in vitro foi influenciada pelo tipo de explante e concentração de BAP. Após os experimentos de transformação genética de segmentos de epicótilo e internodal das tangerinas 'Fremont', 'Thomas' e 'Nules', as plantas regeneradas foram analisadas por PCR, Southern blot e RT-qPCR e confirmadas como transgênicas pela presença e transcrição do gene attA no tecido vascular. A transformação genética de suspensões celulares mostrou-se eficiente com alta produção de antocianina nos embriões somáticos regenerados de tangerina 'W-Murcott', de laranja doce 'Hamlin' e de tangelo 'Page'. A transformação genética direta de protoplastos de tangerina 'W-Murcott' mostrou-se viável e também foi possível a obtenção de embriões somáticos transgênicos. Os fatores de transcrição VvmybA1 e Ruby se mostraram úteis para detecção visual do material transgênico
Title in English
In vitro organogenesis and genetic transformation of mandarin varieties (Citrus reticulata Blanco e Citrus clementina hort. ex Tan.).
Keywords in English
Citrus production
Gene expression
Greening (Plant disease)
Plant molecular genetics
Plant tissue culture
Protoplasts
Somatic embryogenesis
Abstract in English
Currently, Huanglongbing (HLB), associated to Candidatus Liberibacter spp., is the main threat to the citrus culture. The conventional plant breeding shows limitations to the obtain new varieties of rootstock and scion, due to factors related to the biology of the genus. In attempt to overcome these barriers, genetic engineering is notable for allowing the introduction of foreign genes, which, besides reducing the time to obtain genetically improved material may confer disease resistance in varieties of agronomic interest. Thus, the objective of the research was the study of in vitro organogenesis, and obtain transgenic plants of 'Fremont', 'Thomas' and 'Nules' mandarins via Agrobacterium tumefaciens with the gene encoding the antibacterial peptide attacin A (attA), controlled by the promoters AtSUC2 and AtPP2, aiming to preferential gene expression in phloem. In addition, the genetic transformation of cell suspensions, via A. tumefaciens, of 'W-Murcott' mandarin, 'Hamlin' sweet orange and 'Page' tangelo and the direct genetic transformation, via PEG, of 'W-Murcott' mandarin protoplasts were evaluated with VvmybA1 and Ruby transcription factors driven by 6105 and DC3 promoters, with preferential expression in embryonic tissues. The in vitro organogenesis of the varieties studied was influenced by the type of explant and BAP concentration. After genetic transformation experiments of epicotyl and internodal segments of 'Fremont', 'Thomas' and 'Nules mandarins, regenerated plants were analyzed by PCR, Southern blot and RT-qPCR and confirmed as transgenic by presence and transcription of attA gene. The genetic transformation of cell suspensions was efficient with high anthocyanin production in the somatic embryos regenerated of 'W-Murcott' mandarin, 'Hamlin' sweet orange and 'Page' tangelo. The direct genetic transformation of 'W-Murcott' mandarin protoplasts revealed to be viable and it was also possible to obtain transgenic somatic embryos. The VvmybA1 and Ruby transcription factors were useful tools for visual detection of transgenic material
 
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Publishing Date
2015-05-25
 
WARNING: The material described below relates to works resulting from this thesis or dissertation. The contents of these works are the author's responsibility.
  • SORIANO, L., et al. Mandarin and mandarin hybrid genetic transformation for resistance to Candidatus Liberibacter asiaticus. In 3rd International Research Conference on Huanglongbing, Orlando/USA, 2013. International Research Conference on Huanglongbing., 2013. Abstract.
  • SORIANO, L., et al. Transformação genética de tangerina visando resistência ao HLB. In XXXVI Congresso Paulista de Fitopatologia, 2013. XXXVI Congresso Paulista de Fitopatologia., 2013. Resumo.
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