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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.64.2019.tde-14072021-152236
Document
Author
Full name
Rodolfo Augusto Maniero
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Piracicaba, 2019
Supervisor
Committee
Figueira, Antonio Vargas de Oliveira (President)
Sluys, Marie Anne van
Teixeira, Marcelo Menossi
Title in Portuguese
Caracterização funcional do gene codificador para transportador de amônio ScAMT3;3 de cana-de-açúcar (Saccharum spp.)
Keywords in Portuguese
Arabidopsis thaliana
Cana-de-açúcar
Expressão heteróloga
Saccharomyces cerevisiae
Transportador de amônio
Abstract in Portuguese
Na crescente demanda mundial por energia limpa, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) representa uma importante cultura para geração de energia renovável de baixo custo e reduzido impacto ambiental. Para atender a essa demanda, o uso de fertilização à base de nitrogênio (N) é essencial para manutenção dos níveis de produtividade da cultura de cana-de-açúcar. No entanto, a cultura de cana-de-açúcar apresenta baixa resposta à aplicação de fertilizantes à base de nitrogênio, contribuindo para a poluição ambiental e consequentes reflexos negativos no balanço energético e econômico para essa cultura. O amônio (NH4+) é a fonte preferencial de N absorvida pela cana-de-açúcar, porém, o conhecimento sobre a regulação do processo do transporte e distribuição de amônio nessa espécie permanece limitado. O transporte de amônio em plantas é mediado pela família de genes AMMONIUM TRANSPORTER (AMT), mas o impacto da funcionalidade desses transportadores na eficiência de uso de N (NUE) em cana-de-açúcar requer elucidação. Em estudos prévios foram identificados em uma biblioteca de BAC (Bacterial Artificial Chromosome) de cana-de-açúcar membros da subfamília AMT2 com expressão em diferentes órgãos nessa espécie para a compreensão quanto à função desses genes na planta. O presente projeto objetivou a caracterização funcional do gene ScAMT3;3 da subfamília AMMONIUM TRANSPORTERS2 (AMT2) de cana-de-açúcar em sistemas heterólogos utilizando mutantes de levedura (Saccharomyces cerevisiae) e Arabidopsis thaliana, defectivos no transporte de amônio. A complementação de levedura com ScAMT3;3 foi capaz de restaurar o crescimento do mutante, além de indicar a sua funcionalidade para o transporte de NH3/H+. Experimentos de localização de atividade promotora de ScAMT3;3 em Arabidopsis utilizando genes repórteres GUS e GFP indicaram a expressão preferencial em tecido foliar, principalmente em células do floema, sendo pouco regulada pelo status e fonte de N. Estes dados corroboram à análise de expressão relativa do gene em cana-de-açúcar. Plantas transgênicas expressando ScAMT3;3 sob regulação do promotor constitutivo 35SCaMV geradas no background genético do mutante quádruplo qko (AtAMT1;1; AtAMT1;2; AtAMT1;3 e AtAMT2;1) de Arabidopsis demonstraram que a expressão ectópica de ScAMT3;3 auxilia no influxo de 15N-amônio raízes e aumenta o acúmulo de biomassa na parte aérea na presença de amônio. Plantas transgênicas expressando promotor endógeno e região codificante de ScAMT3;3 também apresentaram acúmulo de massa fresca na parte aérea em presença de amônio. Experimentos de acúmulo de 15N-amônio em folhas indicaram que a função de ScAMT3;3 não está associada ao processo de remobilização em deficiência de N, mas sim ao possível processo de translocação em disponibilidade de N
Title in English
Functional characterization of gene encoding ammonium transporter ScAMT3;3 from sugarcane (Saccharum spp.)
Keywords in English
Ammonium transporter
Arabidopsis thaliana
Heterologous expression
Saccharomyces cerevisiae
Sugarcane
Abstract in English
In the growing world demand for clean energy, sugarcane (Saccharum spp.) represents an important crop for low-cost renewable energy generation with low environmental impact. To meet this demand, the use of nitrogen-based fertilization is essential to maintain the productivity levels of the sugarcane crop. However, sugarcane plants present low response to the application of nitrogen-based fertilizers, contributing to environmental pollution and consequent negative impacts on the energy and economic balance for this crop. Ammonium is the preferred source of N absorbed by sugarcane, but knowledge about the regulation of the transport process and the distribution of ammonium in this species remains limited. Ammonium transport in plants is mediated by the AMMONIUM TRANSPORTER (AMT) gene family, but the impact of the functionality of these carriers on the N use efficiency (NUE) in sugarcane requires elucidation. In previous studies, BAC (Bacterial Artificial Chromosome) libraries of AMT2 subfamily with expression in different organs in this species were identified in order to understand the function of these genes in the plant. The present study aimed at the functional characterization of the ScAMT3;3 gene from the AMT2 subfamily of sugarcane in heterologous systems using mutants of yeast (Saccharomyces cerevisiae) and Arabidopsis thaliana, defective in ammonium transport. Yeast complementation with ScAMT3;3 was able to restore the growth of the mutant, besides indicating its functionality for NH3/H+ transport. Experimental localization of ScAMT3;3 promoter activity in Arabidopsis using GUS and GFP reporter genes indicated preferential expression in leaf tissue, mainly in phloem cells, being poorly regulated by the status and source of N. These data corroborate the results obtained from the analysis of relative expression of the gene in sugarcane. Transgenic plants expressing ScAMT3;3 under regulation of the constitutive 35SCaMV promoter generated in the genetic background of the qko mutant (AtAMT1;1; AtAMT1;2; AtAMT1;3 and AtAMT2;1) of Arabidopsis demonstrated that the ectopic expression of ScAMT3;3 helps the influx of 15N-ammonium roots and increases the accumulation of biomass in shoots in the presence of ammonium. Transgenic plants expressing the endogenous promoter and coding region for ScAMT3;3 also presented accumulation of fresh mass in shoots in the presence of ammonia. 15N-ammonium accumulation experiments on leaves indicated that the function of ScAMT3;3 is not associated to the remobilization process in N deficiency, but to the possible translocation process in N availability
 
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Publishing Date
2021-08-10
 
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