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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.64.2019.tde-14072021-134554
Documento
Autor
Nombre completo
Carolina Rossi de Oliveira
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Piracicaba, 2019
Director
Tribunal
Martinelli, Adriana Pinheiro (Presidente)
Boava, Leonardo Pires
Ferreira, Marcio Alves
Lubini, Greice
Título en portugués
Caracterização de uma fosfatidilinositol 4-quinase putativa e seu efeito no desenvolvimento do grão de pólen
Palabras clave en portugués
Arabidopsis thaliana
Desenvolvimento reprodutivo masculino
Expressão heteróloga
Interatores proteicos
Tráfego vesicular
Resumen en portugués
O desenvolvimento dos grãos de pólen está intimamente relacionado à viabilidade dos mesmos e esta pode afetar significativamente o sucesso reprodutivo das plantas. No interior das anteras, as células esporogênicas masculinas se diferenciam e sofrem meiose para produzir micrósporos, que dão origem às unidades independentes de dispersão, os grãos de pólen. Estes mecanismos de desenvolvimento e maturação dos grãos de pólen são influenciados pelo tráfego de vesículas e endomembranas celulares. Desta forma, conhecer os mecanismos moleculares que dirigem e coordenam o desenvolvimento dos grãos de pólen são fundamentais, pois geram informações que podem elucidar o funcionamento e vias regulatórias que levam à diferenciação celular, morfogênese e controle gênico ao longo do desenvolvimento dos grãos de pólen. Na literatura encontra-se a identificação do gene AtPI4K?1(At2g40850), que codifica para uma fosfatidilinositol 4-quinase putativa, predominantemente expressa durante a meiose e a maturação dos grãos de pólen. Estudos ultraestruturais em plantas mutantes para esse gene mostraram grãos de pólen de formato irregular com viabilidade reduzida, indicando possíveis implicações desse produto gênico no desenvolvimento do grão de pólen. O presente trabalho tem como objetivo a caracterização do gene At2g40850 e o estudo de seu envolvimento no desenvolvimento de grãos de pólen. A caracterização comparativa do desenvolvimento de anteras e de pólen por microscopia de luz e eletrônica de transmissão em Arabidopsis thaliana selvagem e mutantes foi realizada, identificando-se em algumas amostras de células de tapete, vacúolos maiores do que nas amostras de material selvagem. Adicionalmente, enquanto anteras do tipo selvagem apresentavam micrósporos circulares vacuolados, anteras mutantes exibiram micrósporos bem desenvolvidos e também micrósporos defeituosos em forma e tamanho, características que podem estar associadas a possíveis defeitos durante a meiose ou a formação de tétrades. Adicionalmente, apesar de não ter sido possível a realização da complementação de mutantes para o gene At2g40850, possivelmente devido à ocorrência de competição gametofítica por grãos de pólen viáveis, os resultados obtidos através de análises de expressão transiente com o auxílio de marcadores de compartimentos celulares (linhas WAVE) em plantas de Nicotiana benthamiana, identificaram a co-localização subcelular da proteína ATPI4K?1 no golgi. Além disso, experimentos envolvendo seleção pelo sistema de duplo híbrido realizadas em amostras de botões florais de A. thaliana, revelaram uma lista de 27 possíveis interatores da proteína codificada pelo gene At2g40850 que podem ser ponto de partida para a elucidação de mecanismos de interação entre proteínas. Por fim, em análises de expressão heteróloga, foi possível obter a expressão da proteína em sistemas bacterianos e a purificação da mesma com alto grau de pureza, mostrando boas perspectivas de estudos futuros para a elucidação da atividade cinásica putativa da proteína ATPI4K?1. As informações geradas neste trabalho podem colaborar para estudos futuros do processo de desenvolvimento de grãos de pólen, aumentando o conhecimento sobre os mecanismos relacionados ao desenvolvimento reprodutivo masculino em plantas
Título en inglés
Characterization of a putative phosphatidyl inositol 4-kinase and its effect on pollen grain development
Palabras clave en inglés
Arabidopsis thaliana
Heterologous expression
Male reproductive development
Protein interactors
Vesicular traffic
Resumen en inglés
The development of pollen grains is closely related to their viability and can significantly affect the reproductive success of plants. Inside the anthers, male sporogenic cells differentiate and undergo meiosis to produce microspores, which give rise to the independent dispersion units, pollen grains. These mechanisms of pollen grain development and maturation are influenced by the traffic of cellular vesicles and endomembranes. Thus, knowing the molecular mechanisms that direct and coordinate the development of pollen grains are fundamental, as they generate information that can elucidate the functioning and regulatory pathways that lead to cell differentiation, morphogenesis and gene control throughout the development of pollen grains. In the literature there is the identification of the AtPI4K?1 gene (At2g40850), which codes for a putative phosphatidylinositol 4-kinase, predominantly expressed during meiosis and pollen grain maturation. Ultrastructural studies in mutant plants for this gene showed irregularly shaped pollen grains with reduced viability, indicating possible implications of this gene product on pollen grain development. The present work aims to characterize the At2g40850 gene and to study its involvement in pollen grain development. Comparative characterization of anther and pollen development by light microscopy and transmission electron microscopy in wild Arabidopsis thaliana and mutants was performed, identifying in some carpet cell samples larger vacuoles than in wild material samples. In addition, while wild anthers had vacuolated circular microspores, mutant anthers exhibited well-developed microspores as well as defective microspores in shape and size, characteristics that may be associated with possible defects during meiosis or tetrad formation. In addition, although mutant complementation to the At2g40850 gene was not possible, possibly due to the occurrence of gametophytic competition for viable pollen grains, the results obtained through transient expression analysis with the aid of compartiment cell markers (WAVE lines) in Nicotiana benthamiana plants identified the subcellular co-localization of ATPI4K?1 protein in golgi. In addition, experiments involving double hybrid system selection performed on A. thaliana flower bud samples revealed a list of 27 possible protein interactors encoded by the At2g40850 gene that may be the starting point for elucidating protein interaction mechanisms. Finally, in heterologous expression analysis, it was possible to obtain protein expression in bacterial systems and to purify it with high purity, showing good prospects for future studies to elucidate the putative kinetic activity of ATPI4K?1 protein. The information generated in this work may contribute to future studies of the pollen grain development process, increasing the knowledge about the mechanisms related to male reproductive development in plants.
 
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Fecha de Publicación
2021-08-10
 
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