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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2021.tde-29092021-083106
Documento
Autor
Nombre completo
Gabriela Carvalho Andrade
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2021
Director
Tribunal
Braga, Gilberto Ubida Leite (Presidente)
Dorta, Daniel Junqueira
Oliveira, Gisele Augusto Rodrigues de
Oliveira, Rhaul de
Título en portugués
Avaliações cito e ecotoxicológicas dos fotossensibilizadores fenotiazínicos atualmente utilizados no tratamento fotodinâmico antimicrobiano
Palabras clave en portugués
Citotoxicidade
Ecotoxicidade
Fotossensibilizadores fenotiazínicos
Risco ecológico
Tratamento fotodinâmico antimicrobiano
Resumen en portugués
O uso indiscriminado de antibióticos e antifúngicos e o consequente aumento do número de linhagens resistentes a esses compostos levaram a uma a busca por tratamentos alternativos capazes de controlar patógenos resistentes. Nesse cenário, o tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFD) é uma alternativa interessante aos antimicrobianos convencionais. A abordagem baseia-se em três componentes: um fotossensibilizador (FS), luz e oxigênio molecular. A exposição do FS à luz resulta na produção local de várias espécies reativas de oxigênio, que matam o micro-organismo sem causar danos significativos ao animal ou à planta hospedeira. Nos últimos anos, o TFD foi proposto para o controle de fitopatógenos. Evidentemente, tal uso implicará na aplicação de grandes quantidades de FS no meio ambiente com a consequente contaminação do solo e dos corpos d'água. Portanto, os pré-requisitos essenciais para o uso de TFD no campo são as avaliações de impacto ecotoxicológico e ambiental desses compostos. O objetivo deste estudo é avaliar a citotoxicidade e a ecotoxicidade de FS fenotiazínicos e comparar tais dados com aqueles obtidos para o antifúngico NATIVO 75WG, comumente utilizado no controle de fungos fitopatogênicos. A citotoxicidade foi avaliada em fibroblastos humanos pelo ensaio de XTT, enquanto que a ecotoxicidade foi avaliada por meio da determinação da toxicidade aguda para o microcrustáceo aquático Daphnia similis e para embriões do peixe Danio rerio. Os FS fenotiazínicos utilizados foram: Azul de Metileno (MB), Novo Azul de Metileno N (NMBN), Azul de Toluidina (TBO) e Dimetil Azul de Metileno (DMMB). Como tratam-se de compostos FS, todas as avaliações foram feitas na presença e na ausência de luz. Nos ensaios de citotoxicidade, o NATIVO foi a substância mais tóxica, com concentração inibitória 50% (IC50) menor do que maior diluição utilizada no ensaio, que foi 10-8 vezes aconcentração do produto utilizada no campo. Em seguida, vieram os FS DMMB, NMBN, TBO e MB, com IC50 de 1,6; 3,8; 10,5 e 122,1 μM, respectivamente, no escuro. A iluminação com luz vermelha reduziu os valores de IC50 para todos os FS. Nos ensaios de ecotoxicidade com D. similis, todos os FS foram muito tóxicos tanto no escuro como no claro. Apesar disso, a magnitude desse fenômeno foi diferente dependendo do FS, sendo os valores de concentração efetiva para MB, NMBN, TBO e DMMB de 2,1; 2,0; 2,9 e 0,8 μM, respectivamente. Nesse caso, houve maior toxicidade do DMMB em relação aos demais FS. Os resultados com D. rerio mostraram que o FS MB foi tóxico apenas na maior concentração utilizada (100 μM), diferindo dos demais FS. A ecotoxicidade foi expressa pelos valores de concentração letal 50 % (LC50). Para o MB, o valor de LC50 não pode ser calculado devido à baixa mortalidade, sendo, portanto, maior que 100 μM. Para os FS NMBN e TBO, os valores de LC50 no escuro são, respectivamente, 49,8 μM e 40,5 μM. No claro, esses valores diminuiram para 15,4 μM e 31,2 μM. Para o DMMB, novamente não foi possível calcular um valor de LC50, mas esse valor é estimado entre 1 e 10 μM tanto na luz quanto no escuro. Todos os FS foram menos tóxicos quando comparados ao antifúngico NATIVO, que causou morte dos embriões de D. rerio mesmo após diluições de 1:1000. Em resumo, pode-se afirmar, baseado nos ensaios de citotoxicidade e de ecotoxicidade, que a ordem crescente de toxicidade dos compostos avaliados é MB < TBO < NMBN < DMMB < NATIVO. Dessa forma, apesar de os FS terem apresentado uma relevante toxicidade, todos eles foram menos tóxicos que o antifúngico amplamente utilizado NATIVO por uma margem considerável. Portanto, o TFD pode e deve ser considerado como método alternativo no controle de patógenos, agora não somente pela menor probabilidade de seleção de linhagens tolerantes, mas também por sua relativa baixa toxicidade ambiental.
Título en inglés
Cytological and ecotoxicological evaluations of the phenothiazinium photosensitizers currently used in antimicrobial photodynamic treatment
Palabras clave en inglés
Antimicrobial photodynamic treatment
Cytotoxicity
Ecological danger
Ecotoxicity
Phenothiazinium photosensitizers
Resumen en inglés
The indiscriminate use of antibiotics and antifungal agents as well as the consequential increase of resistance have led to a continuous search for alternative treatments dealing with resistant pathogens. In this context, antimicrobial photodynamic treatment (PDT) has emerged as a promising alternative to conventionally used antimicrobials. PDT is based on three components: a photosensitizer (PS), light, and molecular oxygen. Exposing the PS to light results in the production of reactive oxygen species that inactivate the target microorganism, with little to no damage to the host organism. In the past years, PDT has been proposed as an effective treatment to control phytopathogenic fungi in crop fields. The continuous use of PS will invariably lead to contamination of soil and water. Therefore, it is essential to evaluate the ecotoxicological and environmental impact of PS. This study proposed a cytotoxicity and ecotoxicity assessment of phenothiazinium PS as well as a comparison between them and the currently used antifungal agent NATIVO 75WG, commonly applied to control phytopathogenic fungi. Cytotoxicity was evaluated in human fibroblasts by the XTT assay whereas ecotoxicity was evaluated both in the microcrustacean Daphnia similis and in zebrafish embryos (Danio rerio). Phenothiazinium PS used were methylene blue (MB), new methylene blue N (NMBN), toluidine blue O (TBO), and dimethyl methylene blue (DMMB). Because PS respond to light, all evaluations were performed both under light and in the dark. In the cytotoxicity assays, NATIVO was the most toxic substance with a 50% inhibitory concentration (IC50) smaller than the highest dilution evaluated, which was 10-8 times the concentration used in the field. Compared to NATIVO, all PS tested displayed lower cytotoxicity and IC50 values in the dark for DMMB, NMBN, TBO, and MB were 1.6, 3.8, 10.5 and 122.1 μM, respectively. Illumination with red light resulted in increased toxicity for all PS. In ecotoxicity assays using D. similis, all PS were very toxic both under light and in the dark. However, DMMB was the most toxic when compared to NMBN, TBO, and MB. The 50% effective concentration for MB, NMBN, TBO, and DMMB were 2.1, 2.0, 2.9 and 0.8 μM, respectively. Experiments with zebrafish revealed that MB was toxic only at the highest concentration used (100 μM), which was significantly different from the all other PS. Ecotoxicity for zebrafish was expressed by means of the 50% lethal concentration (LC50). For MB, this value could not be calculated due to low mortality and is therefore >100 μM. For NMBN and TBO, calculated LC50 in the dark were 49.8 and 40.5 μM, respectively. Illumination reduced these values to 15.4 and 31.2 μM. For DMMB it was also not possible to calculate LC50, but the estimated value is 1-10 μM both under light and in the dark. All PS were less toxic when compared to NATIVO, for which mortality only ceased for dilutions higher than 1:1000 the initial concentration. It can be said, based on both cyto and ecotoxicological assessments, that toxicity increases in the following order: MB < TBO < NMBN < DMMB < NATIVO. Even though the PS tested presented relevant toxicity, all were less toxic than the currently used antifungal agent NATIVO by a considerable margin. Therefore, PDT can and should be considered a safe and valid alternative to control pathogens, not only because the selection of resistant strains is unlikely, but also because its use poses relatively fewer environmental consequences.
 
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Fecha de Liberación
2023-05-11
Fecha de Publicación
2021-09-29
 
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