As espécies da ordem Enterobacterales são micro-organismos oportunistas envolvidos em uma grande variedade de infecções, principalmente em seres humanos. Essas infecções são agravadas quando associadas às linhagens multidrogas resistentes (MDR). As Enterobacterales estão amplamente distribuídas em diferentes nichos, incluindo fontes ambientais. Os ecossistemas aquáticos são reconhecidos como importantes reservatórios de bactérias MDR e seus genes de resistências aos antimicrobianos (ARGs), os quais podem atuar co-selecionando bactérias tolerantes aos metais através da aquisição de plasmídeos. Nesse sentido, este estudo teve como objetivo caracterizar fenotipicamente e molecularmente isolados ambientais de Enterobacterales obtidos de diferentes mananciais do estado de São Paulo. Um total de 86 amostras de água foram coletadas de 57 cidades. A partir disso, 254 isolados foram obtidos, sendo 56 deles pertencentes a ordem Enterobacterales, incluindo Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens e complexo Enterobacter cloacae. Dentre os isolados obtidos, 46 foram classificados como MDR, visto que exibiram amplos perfis de resistência aos β-lactâmicos, aos aminoglicosídeos, às fluorquinolonas, às tetraciclinas, às sulfonamidas, aos fenicóis e à colistina. Um total de 415 amplicons de ARGs foram encontrados, destacando os genes blaKPC, blaNDM, blaCTX-M-like e blaGES Dentre os ARGs detectados, os genes blaTEM, oqxA, oqxB, sul2, tetA e aac(3')-IIa foram os mais prevalentes. Em relação a tolerância aos metais, foi detectada tolerância à prata, ao cobre, ao cádmio e ao mercúrio, e os seguintes genes de tolerância (MTGs) foram encontrados: rncA, silA, pcoA, merA e chrA. Além disso, uma grande variedade de replicons de plasmídeos foi identificada, incluindo ColE-like, IncF, IncN, IncA/C, IncFIB, IncFIA, IncR, IncI, IncH1, IncU e IncP. A análise baseada em sequência de genoma completo revelou que os isolados de K. pneumoniae pertenciam ao grupo pandêmico clonal 258. O gene blaKPC-2 foi identificado em um plasmídeo IncN-pST15 associado ao Tn4401, enquanto que o gene blaNDM-1 foi encontrado no plasmídeo IncC3 associado ao Tn125-like. O gene blaCTX-M-15 foi detectado em um plasmídeo multireplicon IncF abrigando a estrutura genética ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477-ΔTn3-like. A presença de Enterobacterales MDR em mananciais sugere que esse ambiente continua atuando como reservatório de bactérias MDR e seus ARGs e também MTGs, contribuindo para a evolução e a disseminação da resistência entre diferentes nichos e espécies.

The species of the Enterobacterales order are opportunistic microorganisms involved in a wide variety of infections, mainly in humans. These infections are aggravated when associated with multidrug-resistant (MDR) strains. Enterobacterales are widely distributed in different niches, including environmental sources. Aquatic ecosystems are recognized as important reservoirs of MDR bacteria and their antimicrobial resistance genes (ARGs), which may favor co-selecting metal-tolerant bacteria through the acquisition of plasmids. In this regard, this study aimed to characterize phenotypically and molecularly environmental isolates of Enterobacterales obtained from different water sources of the São Paulo State. Eighty-six water samples were collected from 57 cities. Accordingly, 254 isolates were recovered, and 56 of them belonged to the Enterobacterales order, including Klebsiella pneumoniae, Klebsiella quasipneumoniae, Escherichia coli, Serratia marcescens, and Enterobacter cloacae complex. Among them, 46 were classified as MDR, exhibiting a large resistance profile to β-lactams, aminoglycosides, fluoroquinolones, tetracyclines, sulfonamides, phenicol, and colistin. A total of 415 ARGs were detected, highlighting the presence of blaKPC, blaNDM, blaCTX-M-like, and blaGES. Among the ARGs, the genes blaTEM, oqxA, oqxB, sul2, tetA, and aac(3')-IIa were the most prevalent. Regarding metal tolerance, silver, copper, cadmium, and mercury tolerance was detected, and the metal tolerance genes (MTGs) rncA, silA, pcoA, merA, and chrA were found. Furthermore, a wide variety of plasmid replicons were obtained, including ColE-like, IncF, IncN, IncA/C, IncFIB, IncFIA, IncR, IncI, IncH1, IncU, and IncP. The whole-genome sequence-based analysis revealed that K. pneumoniae isolates belonged to the clonal group 258. The gene blaKPC-2 was located on an IncN-pST15 plasmid associated with the Tn4401, while the gene blaNDM-1 was found on an Inc3 plasmid associated with the Tn125-like. The gene blaCTX-M-15 was found on a multireplicon plasmid IncF attributed to the ISEcp1-blaCTX-M-15-Δorf477-Δ-Tn3-like genetic structure. The presence of MDR Enterobacterales in surface waters suggests that this source continues to act as a reservoir for MDR bacteria and their ARGs and also MTGs, contributing to the evolution and dissemination of resistance among different niches and species.