A preocupação com impactos ambientais tem estimulado muitos esforços visando substituir os combustíveis fósseis por biocombustíveis, como o etanol. Porém, para tornar isso possível, é necessário investir em outras tecnologias de produção, como o etanol de segunda geração (2G), de modo a elevar os níveis desse produto e assim atender à crescente demanda. Atualmente, esse tipo de produção ainda não é viável economicamente, devido aos altos custos dos coquetéis enzimáticos utilizados na etapa de sacarificação das biomassas lignocelulósicas. De modo a otimizar esses coquetéis, a busca por enzimas com atividades superiores tem sido visada. As β-glicosidases, atuam na etapa final da sacarificação enzimática, catalisando a clivagem de ligações glicosídicas presentes na celobiose, liberando glicose e aumentando a eficiência das enzimas hidrolíticas que são inibidas pela celobiose no processo de hidrólise. Dessa forma, o projeto em questão realizou a clonagem, expressão em Pichia pastoris X-33, purificação e caracterização da enzima AfBgl1.3 de A. fumigatus. A avaliação estrutural da enzima recombinante, revelou a desestruturação da enzima devido ao aumento da temperatura. Na análise por dicroísmo circular (DC), foi possível observar a perda progressiva da estrutura α-hélice e aumento da estrutura folha-β antiparalela, e permitiu determinar o valor de Tm aparente de 48,5 °C. Em adição, foi possível predizer a proporção das estruturas secundárias α-hélice (36,3%) e folha-β (12,4%), a 25 °C. A análise por emissão intrínseca do triptofano permitiu determinar a exposição dos resíduos apolares no ambiente externo da proteína, obtendo-se o valor de Tm aparente de 49,3 °C. A caracterização bioquímica sugeriu as condições ótimas para sua atividade sendo de pH 6,0 e temperatura de 40 °C. Nas temperaturas de 30 °C e 40 °C, a enzima apresenta-se estável, retendo cerca de 90 e 50% de atividade, respectivamente, após 24 horas de pré-incubação. A enzima também demonstrou alta estabilidade na faixa de pH 5-8, retendo mais que 65 % de sua atividade após 48 horas de pré-incubação. Como a inibição pelo produto é um dos desafios na utilização industrial de β-glicosidases, principalmente durante a degradação de celulose, avaliou-se a sua tolerância a glicose. A AfBgl1.3 recombinante foi estimulada em uma ampla faixa de concentração de glicose (1,8 - 90 g L-1), aumentando cerca de 1,4 vezes sua atividade, na presença de 45 g L-1 de glicose. A enzima ainda apresentou atividade sobre os substratos salicina (495,0 ± 49,0 U mg-1), pNPG (340,5 ± 18,6 U mg-1), celobiose (89,3 ± 5,1 U mg-1) e lactose (45,1 ± 0,5 U mg-1), podendo ser classificada como de ampla especificidade. Os valores de Vmax encontrados para a AfBgl1.3, foram de 656,0 ± 17,5 U mg-1, 706,5 ± 23,8 U mg-1 e 132,6 ± 7,1 U mg-1, para os substratos pNPG, Salicina e celobiose, respectivamente. A enzima atuou em sinergia com o coquetel enzimático comercial (Celluclast® 1.5L), uma vez que sua adição como suplemento, resultou em aumentos de cerca de 26% na taxa de conversão do substrato CMC em açúcares redutores (g L-1), após 12 horas de incubação na presença de 0,9 FPU/g de coquetel. Além disso a AfBgl1.3 também atuou em sinergia com as outras celulases do Aspergillus fumigatus já caracterizadas por nosso grupo de pesquisa sobre a degradação de CM-Celulose, o que resultou em maior liberação de açúcares redutores em relação ao controle. Os resultados obtidos podem ser importantes no contexto da busca por novas celulases e na otimização dos coquetéis enzimáticos utilizados durante a sacarificação.

Concern about environmental impacts has stimulated many efforts to replace fossil fuels with biofuels, such as ethanol. However, to make this possible, it is necessary to invest in other production technologies, such as second-generation ethanol (2G), in order to raise the levels of this product and thus meet the growing demand. Currently, this type of production is not yet economically viable, due to the high costs of the enzymatic cocktails used in the saccharification step of lignocellulosic biomass. In order to optimize these cocktails, the search for enzymes with superior activities has been pursued. β-glycosidases act in the final step of enzymatic saccharification, catalyzing the cleavage of glycosidic bonds present in cellobiose, releasing glucose and increasing the efficiency of hydrolytic enzymes that are inhibited by cellobiose in the hydrolysis process. Thus, the project in question carried out the cloning, expression in Pichia pastoris X-33, purification and characterization of the AfBgl1.3 enzyme from A. fumigatus. The structural evaluation of the recombinant enzyme revealed the destructuring of the enzyme due to the increase in temperature. In the circular dichroism (CD) analysis, it was possible to observe the progressive loss of the α-helix structure and the increase of the antiparallel β-sheet structure, and it was possible to determine the apparent Tm value of 48.5 °C. In addition, it was possible to predict the proportion of α-helix (36.3%) and β-sheet (12.4%) secondary structures at 25 °C. The intrinsic emission analysis of tryptophan allowed to determine the exposure of apolar residues in the external environment of the protein, obtaining the apparent Tm value of 49.3 °C. The biochemical characterization suggested the optimal conditions for its activity being pH 6.0 and temperature of 40 °C. At temperatures of 30 °C and 40 °C, the enzyme is stable, retaining about 90 and 50% of activity, respectively, after 24 hours of pre-incubation. The enzyme also demonstrated high stability in the pH 5-8 range, retaining more than 65% of its activity after 48 hours of pre-incubation. As inhibition by the product is one of the challenges in the use of β-glucosidases industrially, mainly in the degradation of cellulose, its glucose tolerance was evaluated. Recombinant AfBgl1.3 was stimulated over a wide range of glucose concentration (1.8 - 90 g L-1), increasing its activity by about 1.4 times in the presence of 45 g L-1 of glucose. The enzyme also showed activity on the substrates salicin (495.0 ± 49.0 U mg-1), pNPG (340.5 ± 18.6 U mg-1), cellobiose (89.3 ± 5.1 U mg-1) and lactose (45.1 ± 0.5 U mg-1), which can be classified as having broad specificity. The Vmax values found for AfBgl1.3 were 656.0 ± 17.5 U mg-1, 706.5 ± 23.8 U mg-1 and 132.6 ± 7.1 U mg-1, for the substrates pNPG, Salicin and cellobiose, respectively. The enzyme acted in synergy with the commercial enzyme cocktail (Celluclast® 1.5L), since its addition as a supplement resulted in increases of about 26% in the conversion rate of the CMC substrate into reducing sugars (g L-1), after 12 hours of incubation in the presence of 0.9 FPU/g of cocktail. In addition, AfBgl1.3 also acted in synergy with other Aspergillus fumigatus cellulases already characterized by our research group on the degradation of CM-Cellulose, which resulted in greater release of reducing sugars compared to the control. The results obtained may be important in the context of the search for new cellulases and in the optimization of enzymatic cocktails used during saccharification.