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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2020.tde-22092021-084330
Documento
Autor
Nombre completo
Tárik Reis Heluy
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2020
Director
Tribunal
Antonietto, Kamilla Swiech (Presidente)
Casciatori, Fernanda Perpetua
Tonso, Aldo
Título en portugués
Produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante em células humanas
Palabras clave en portugués
Fator VII da coagulação
Hemofilia
Linhagens celulares humanas
Metabolismo celular
Otimização
Vitamina K
Resumen en portugués
A maioria das proteínas terapêuticas recombinantes complexas são produzidas em células de mamíferos, principalmente células CHO. Apesar de apresentarem uma capacidade de expressar proteínas com modificações pós-traducionais (MPTs) similares à humana, essas células podem expressar padrões de glicosilação que são imunogênicos para seres humanos. Nesse sentido, as linhagens celulares humanas surgem como um sistema de expressão promissor, principalmente pela capacidade de produzir proteínas com glicosilação mais próxima ao organismo humano. Este trabalho tem como objetivo analisar a capacidade de quatro linhagens celulares humanas para produção de fator VII recombinante da coagulação sanguínea humana (FVIIr), proteína terapêutica utilizada no tratamento de pacientes hemofílicos que desenvolveram inibidores contra o fator IX (FIX) ou fator VIII (FVIII) da coagulação, em suspensão em meios livres de soro fetal (SFB). As linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HKB-11, HEK293SF e Huh-7 foram cultivadas em erlenmeyers (150 rpm, 5% de CO2, 37°C) para comparação do potencial de expressão de FVIIr e atividade biológica dessa proteína. Foi possível observar no sobrenadante de 48h, por meio de ELISA, uma concentração de 148,5 ng/mL, 172,5 ng/mL, 72,3 ng/mL e 32 ng/mL, respectivamente, para as células SK-Hep-1, HKB-11, Huh-7. A atividade biológica foi conferida por meio de TP, onde foram obtidos valores de 3,6 UI/mL, 3,15 UI/mL, 0,72 UI/mL e 0 UI/mL para as células SK-Hep-1, HKB-11, Huh-7 e HEK293SF, respectivamente. A célula HKB-11 foi escolhida para a etapa seguinte do trabalho, que envolveu a suplementação com vitamina K em duas diferentes concentrações, 1,0 e 2,5 μg/mL, visando o aumento tanto da expressão quanto da atividade biológica do FVIIr. Foi possível observar que o aumento da concentração de vitamina K no meio de cultura não influenciou o crescimento e metabolismo celular de maneira significativa quando comparados ao controle (sem vitamina), entretanto, os resultados obtidos para expressão e atividade biológica foram superiores para a célula cultivada em 1,0 μg/mL em relação àquela cultivada em 2,5 μg/mL. Um delineamento experimental do tipo Box-Behnken, com quatro fatores (ácido cítrico, butirato de sódio (NaBu), glutationa reduzida (GSH) e temperatura de cultivo) e 27 ensaios foi executado em tubos minibiorreator (180 rpm, 5% de CO2, 37°C) tendo como objetivo o aumento da expressão de FVIIr e da produtividade específica (qFVIIr). Dois modelos matemáticos significativos foram obtidos com o delineamento experimental e a partir da função desejabilidade, foi possível determinar os valores de 2 mM de NaBu, 2,5 mM de GSH e 34°C como condições ótimas para obtenção de 1 μg/mL de FVIIr e produtividade específica de 7 ng/106células/h, valores bastantes significantes quando comparados a diversos trabalhos presentes na literatura.
Título en inglés
Production of recombinant blood coagulation factor VII in human cel lines
Palabras clave en inglés
Cell metabolism
Coagulation factor VII
Hemophilia
Human cell lines
Optimization
Vitamin K
Resumen en inglés
Most complex recombinant therapeutic proteins are produced in mammalian cells, mainly CHO cells. Despite having an ability to express complex proteins with post-translational modifications (PTMs) similar to humans, these cells can express glycosylation patterns that are immunogenic for humans. In this sense, human cell lines appear as a promising expression system, mainly due to the ability to produce proteins with glycosylation closer to the human organism. This work aims to analyze the capacity of four human cell lines to produce recombinant human blood coagulation factor VII (rFVII), a therapeutic protein used in the treatment of hemophiliac patients who have developed inhibitors against factor IX (FIX) or factor VIII (FVIII) of coagulation, in serum-free suspension culture conditions (SFM). The human cell lines SK-Hep-1, HKB-11, HEK293SF, and Huh-7 were grown in Erlenmeyer (150 rpm, 5% CO2, 37°C) to compare the FVIIr expression potential and biological activity. It was possible to observe a concentration of 148.5 ng/mL, 172.5 ng/mL, 72.3 ng/mL and 32 ng/mL in the 48h supernatant, respectively, for SK-Hep cells -1, HKB-11, Huh-7. The biological activity was checked using TP, where values of 3.6 IU/mL, 3.15 IU/mL, 0.72 IU/mL, and 0 IU/mL were obtained for SK-Hep-1, HKB -11, Huh-7 and HEK293SF cells, respectively. The HKB-11 cell was chosen for the next step of the work, which involved supplementation with vitamin K in two different concentrations, 1.0 and 2.5 μg/mL, aiming an increasing both the expression and the biological activity of the expressed FVIIr. It was possible to observe that the increase in the concentration of vitamin K in the culture medium did not significantly influence cell growth and metabolism when compared to the control (without vitamin), however, the results obtained for expression and biological activity were superior for the cultured cell at 1.0 μg / mL compared to that grown at 2.5 μg / mL. A Box-Behnken experimental design, with four factors (citric acid, sodium butyrate (NaBu), reduced glutathione (GSH) and culture temperature) and 27 runs was performed in mini-bioreactor tubes (180 rpm, 5% CO2, 37°C) aiming an increasing FVIIr expression and specific productivity (qFVIIr). Two significant mathematical models were obtained with the experimental design and from the desirability function, it was possible to determine the values of 2 mM NaBu, 2.5 mM GSH and 34°C as optimal conditions to obtain 1 μg/mL of FVIIr and specific productivity of 7 ng/106 cells/h, very significant values when compared to several studies presents in literature.
 
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Fecha de Publicación
2021-09-24
 
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