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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2021.tde-29092021-080913
Document
Author
Full name
Fábio Roque Kubata
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Baruffi, Marcelo Dias (President)
Papoti, Marcelo
Vieira, Davi Serradella
Title in Portuguese
Estudo da interação entre galectina-1 e actina sarcomérica
Keywords in Portuguese
Actina sarcomérica
Galectina-1
Músculo esquelético
Abstract in Portuguese
A contração muscular é um processo vital, complexo e multimediado. As duas principais proteínas que atuam neste processo são a actina e a miosina. Os mecanismos moleculares envolvidos na fisiologia da contração muscular ainda não estão totalmente esclarecidos. A galectina-1 (Gal-1) é uma proteína multifuncional que se liga a β-galactosídeos por meio de seu domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD). Esta proteína está envolvida em vários eventos associados ao tecido muscular como a fusão de miotubos, desenvolvimento e reparo deste tecido. Interessantemente, foi demonstrando que a expressão de Gal-1 na musculatura, esquelética e cardíaca, apresenta um padrão estriado caracterizado por sua colocalização com a actina sarcomérica, o que sugere uma interação direta entre estas moléculas. Este trabalho teve com objetivos a confirmação da ocorrência e a caracterização da interação entre Gal-1 e actina sarcomérica. Neste estudo foram utilizadas as formas recombinantes humana de Gal-1 e de Gal-3 (galectina controle) e preparações das formas monomérica (Actina-G) e filamentosa (Actina-F) de actina purificada de músculo de coelho. A análise experimental da potencial interação entre estas moléculas, em solução, foi monitorada por analises eletroforéticas em condições nativas; dissociantes e redutoras na presença ou ausência de agente de ligação cruzada. A investigação da interação entre Gal-1 e estas duas formas de actina sarcomérica, em fase sólida, foi feita por ELISA. Além disso, foram realizados ensaios de viscosimetria a partir de soluções contendo Gal-1 e Actina-G ou Actina-F. Após a constatação de ligação entre Gal-1 e actina sarcomérica, foram construídos modelos de interação com o uso de estratégias in sílico de modelagem e ancoragem moleculares. As análises eletroforéticas indicaram que Gal-1 e Gal-3 não se ligaram à Actina-G, porém, com o uso do teste de ELISA foi demonstrado que Gal-1 interage apenas com Actina-F. A adição de Gal-1 em soluções destas duas formas de actina, provocou aumento de viscosidade apenas na solução de Actina-F. A propriedade de Gal-1 reconhecer carboidratos não participa do mecanismo molecular de sua interação com Actina-F, uma vez que a lactose não inibiu a ligação entre estas proteínas. As análises de bioinformática indicaram que Gal-1 pode se ligar na extremidade "barbed end" de Actina-F e, de forma termodinamicamente mais favorável, na interface entre subunidades adjacentes desta proteína filamentosa. Em conclusão, Gal-1 pode se ligar nas extremidades e interfaces das subunidades de Actina-F e promover a formação de retículos e/ou o favorecimento da polimerização desta proteína muscular em solução. Este conjunto de resultados sugere que a Gal-1 pode participar do mecanismo de contração muscular por meio de uma interação direta com a Actina-F de modo independente de sua atividade lectínica.
Title in English
Study of the interaction between galectin-1 and sarcomeric actin
Keywords in English
Galectin-1
Sarcomeric actin
Skeletal muscle
Abstract in English
Muscle contraction is a vital, complex and multi-mediated process. The two main proteins that act in this process are actin and myosin. The molecular mechanisms involved in the physiology of muscle contraction are not yet fully understood. Galectin- 1 (Gal-1) is a multifunctional protein that binds to β-galactosides through its carbohydrate recognition domain (CRD). This protein is involved in several events associated with muscle tissue such as the fusion of myotubes and the development and repair of this tissue. Interestingly, it was demonstrated that the expression of Gal-1 in muscle, skeletal and cardiac, presents a striated pattern characterized by its colocation with sarcomeric actin, which suggests a direct interaction between these proteins. This study aimed to confirm the occurrence and characterize the interaction between Gal-1 and sarcomeric actin. In this study, human recombinant forms of Gal-1 and Gal-3 (control galectin) and preparations of the monomeric (G-Actin) and filamentous (F-Actin) forms of purified rabbit muscle actin were used. The experimental analysis of the potential interaction between these molecules, in solution, was monitored by electrophoretic analysis under native conditions; dissociating and reducing agents in the presence or absence of a cross-linking agent. The investigation of the interaction between Gal-1 and these two forms of sarcomeric actin, in solid phase, was carried out by ELISA. In addition, viscosimetry assays were performed using solutions containing Gal-1 and G-Actin or F-Actin. After finding a link between Gal-1 and sarcomeric actin, interaction models were built using molecular modeling and docking strategies. Electrophoretic analyzes indicated that Gal-1 and Gal-3 did not bind to Actin-G, however, using the ELISA test it was shown that Gal-1 interacts only with F-Actin. The addition of Gal-1 in solutions of these two forms of actin, caused an increase in viscosity only in the solution of F-Actin. The property of Gal-1 to recognize carbohydrates does not participate in the molecular mechanism of its interaction with F-Actin, since lactose did not inhibit the binding between these proteins. Bioinformatics analyzes indicated that Gal-1 can bind to the "barbed end" end of F-Actin and, thermodynamically more favorably, to the interface between adjacent subunits of this filamentous protein. In conclusion, Gal-1 can bind to the ends and interfaces of the F-Actin subunits and promote the formation of reticles and / or favor the polymerization of this muscle protein in solution. This set of results suggests that Gal-1 can participate in the muscle contraction mechanism through a direct interaction with F-Actin independently of its lectin activity.
 
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Release Date
2023-04-20
Publishing Date
2021-09-29
 
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