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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2019.tde-27102021-123822
Documento
Autor
Nome completo
João Rodrigues Lima Júnior
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2019
Orientador
Banca examinadora
Farias, Kelen Cristina Ribeiro Malmegrim de (Presidente)
Bonomo, Adriana Cesar
Castro, Fabíola Attié de
Machado, Cleni Mara Marzocchi
Passos Junior, Geraldo Aleixo da Silva
Panepucci, Rodrigo Alexandre
Título em português
Avaliação imunofenotípica, funcional e gênica de subpopulações de células B em pacientes com esclerose sistêmica submetidos ao transplante autólogo de células-tronco hematopoiética
Palavras-chave em português
Autoimunidade
Células B
Esclerose sistêmica
IL-10
Imunorregulação
Reconstituição imunológica
Transplante autólogo de células-tronco hematopoiética
Resumo em português
A esclerose sistêmica (ES) é uma doença autoimune inflamatória crônica, caracterizada por alterações microvasculares e diferentes graus de fibrose da pele e de múltiplos órgãos. Atualmente, o transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas (TACTH) é o único tratamento capaz de promover remissão clínica de longo prazo em pacientes com ES, sem a necessidade do uso de terapias adicionais. No entanto, os mecanismos imunológicos envolvidos nessa terapia não são ainda completamente compreendidos, incluindo o papel de subpopulações de células B. Nesse contexto, nesse trabalho avaliamos a reconstituição quantitativa e funcional de subpopulações de células B convencionais e reguladoras (Bregs) pacientes com ES tratados com TACTH (n=24). As seguintes subpopulações de células B do sangue periférico foram analisadas por citometria de fluxo, antes e após 30, 60, 120, 180 e 360 dias do TACTH: CD19+IgD+CD27- (naïve), CD19+CD27+IgD+ (memória sem mudança de classe de isotipo), CD19+CD27+IgD- (memória com mudança de classe de isotipo), CD19+IgD-CD27hi (plasmócito), CD19+IgD-CD27- (memória duplo negativa), CD19+CD38-IgD+ (Bm1, naive virgem), CD19+CD38+IgD+ (Bm2, naive ativada), CD19+CD38hiIgD+ (Bm2', pré centro germinativo), CD19+CD38hiIgD- (Bm3+4, centroblasto+centrócito), CD19+CD38+IgD- (early Bm5, memória recente) e CD19+CD38-IgD- (late Bm5, memória tardia), CD19+PD1+, CD20+CD27+CD43+CD69- (B1), CD19+CD24hiCD38hi (Breg transicional), CD19+CD24hiCD27+ (Breg B10). Após o transplante, os pacientes com ES apresentaram diminuição significativa do escore cutâneo de Rodnan modificado, dos níveis séricos de proteína C reativa e do autoanticorpo anti-Scl70. Seis pacientes apresentaram reativação da doença durante o seguimento pós-transplante. As células B naive foram eliminadas pelo regime de condicionamento e 360 dias pós-transplante apresentaram número absoluto maior que os encontrados no período pré-transplante. O número absoluto de células B de memória diminuiu transientemente, retornando aos valores basais 360 dias após o transplante. Paralelamente, logo após o transplante, observamos aumento da expressão de PD-1 nas células B, aumento transiente dos níveis séricos de BAFF e diminuição transiente dos níveis séricos de APRIL. Pacientes reativados apresentaram aumento de células B PD-1+ logo após o transplante. Observamos um aumento significativo de Bregs transicionais nos pacientes que responderam ao TACTH em comparação com os que reativaram a doença. As Bregs B10 aumentaram a produção de IL-10 de maneira transiente após o TACTH, enquanto que as Bregs transicionais apresentaram um aumento de IL-10 persistente ao longo de todo o seguimento. Corroborando esses achados, a fosforilação das proteínas intracelulares ERK1/2 e p38 MAPK, relacionadas a produção de IL-10 por células B, aumentou após o transplante, enquanto a fosforilação de STAT3 manteve-se inalterada. Além disso, as Bregs transicionais readquiriram a capacidade de suprimir a proliferação de células T CD4+, bem como a produção de TNF-α e IFN-γ por estas células. Por outro lado, a produção de TGF-β por células B maduras diminuiu transientemente, ii enquanto a produção de IL-6 diminuiu de maneira persistente ao longo do seguimento pós-transplante. Observamos também uma modulação da expressão de 13 genes relacionados a resposta inflamatória e autoimunidade 360 dias pós-TACTH, em comparação ao período pré-transplante. Em conjunto, sugerimos todos esses mecanismos atuam sinergicamente no restabelecimento da autotolerância imunológica e diminuição da inflamação e fibrose nos pacientes com ES que respondem satisfatoriamente ao TACTH. Os resultados obtidos nesse trabalho contribuíram para aumentar o conhecimento sobre a reconstituição numérica e funcional do compartimento de células B após o TACTH em pacientes com ES. Este conhecimento poderá futuramente contribuir para melhorias do protocolo clínico de TACTH para ES e outras doenças autoimunes.
Título em inglês
Immunophenotypic, functional and gene evaluation of B cell subsets in patients with systemic sclerosis undergoing autologous hematopoietic stem cell transplantation
Palavras-chave em inglês
Autoimmunity
Autologous hematopoietic stem cell transplantation
B cells
IL-10
Immune reconstitution
Immunoregulation
Systemic sclerosis
Resumo em inglês
Systemic sclerosis (SSc) is a chronic inflammatory autoimmune disease, which is characterized by microvascular changes and different degrees of skin and multiple organ fibrosis. Autologous hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) is currently the only treatment capable of promoting long-term clinical remission in SSc patients without the need for additional therapies. However, the immunological mechanisms involved in this therapy are not yet fully understood, including the role of B cell subpopulations. In this context, in this work we evaluated the quantitative and functional reconstitution of conventional and regulatory B cell subpopulations (Bregs) in patients with SSc treated with AHSCT (n=24). The following peripheral blood B cell subpopulations were analyzed by flow cytometry, before and after 30, 60, 120, 180 and 360 days after AHSCT: CD19+IgD+CD27- (naive), CD19+CD27+IgD+ (memory with class switch), CD19+CD27+IgD- (memory without class switch), CD19+IgD-CD27hi (plasmócito), CD19+IgD-CD27- (memory double negative), CD19+CD38-IgD+ (Bm1, naive), CD19+CD38+IgD+ (Bm2, activated naive), CD19+CD38hiIgD+ (Bm2', pre-germinative center), CD19+CD38hiIgD- (Bm3+4, centroblasts+centrocytes), CD19+CD38+IgD- (early memory Bm5) e CD19+CD38-IgD- (late memory Bm5,), CD19+PD1+, CD20+CD27+CD43+CD69- (B1 cells), CD19+CD24hiCD38hi (transitional Breg), CD19+CD24hiCD27+ (B10 Breg). After transplantation, patients with SSc had a significant decrease in modified Rodnan skin score, serum reactive C protein and anti-Scl70 autoantibody. Six patients had disease reactivation during the post-transplant follow-up. Naive B cells were eliminated by the conditioning regimen and 360 days after transplantation showed hier absolute number than those found in the pre-transplantation period. The absolute number of memory B cells decreased transiently, returning to baseline 360 days after transplantation. In parallel, early after transplantation, we observed increased expression of PD-1 in B cells, transient increase in serum BAFF levels, and transient decrease in serum APRIL levels. Reactivated patients had increased PD-1+ B cell numbers early after transplantation. We observed a significant increase of transitional Bregs in patients who responded to AHSCT compared with those who reactivated the disease. Bregs B10 increased transiently the IL-10 production after AHSCT, while transitional Bregs showed a persistent increase of IL-10 production throughout the follow-up. Corroborating these findings, the phosphorylation of intracellular proteins ERK1/2 and p38 MAPK, which is related to B-cell IL-10 production, increased after transplantation, while STAT3 phosphorylation remained unchanged. In addition, transitional Bregs have recovered the ability to suppress CD4+ T cell proliferation, as well as the production of TNF-α and IFN-γ by these cells. On the other hand, TGF-β production by mature B cells decreased transiently, while IL-6 production persistently decreased throughout the post-transplant follow-up. We also observed a modulation of expression of 13 genes related to inflammatory response and autoimmunity 360 days post-AHSCT, compared to the pre-transplant period. Altogether, we suggest that these mechanisms act synergistically in restoring immune self-tolerance and decreasing iv inflammation and fibrosis in SSc patients who respond satisfactorily to AHSCT. The results obtained in this work contributed to increase the knowledge about the numerical and functional reconstitution of the B cell compartment after AHSCT in patients with SSc. This knowledge may contribute in the future to improvements in the clinical protocol of AHSCT for SSc and other autoimmune diseases.
 
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Data de Liberação
2021-11-11
Data de Publicação
2021-11-10
 
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