As células estromais mesenquimais (MSC) têm sido usadas no tratamento de uma variedade de doenças devido ao seu notável potencial regenerativo, imunossupressor e imunomodulador. No entanto, muitos estudos clínicos revelaram resultados limitados, que têm levado pesquisadores à busca de estratégias que melhorem a eficácia terapêutica dessas células. É importante ressaltar que a aplicação clínica de MSC requer a implementação de bioprocessos de expansão celular escalonáveis combinados com condições de cultivo isentas de xenoantígenos. O objetivo geral deste trabalho foi caracterizar e avaliar funcionalmente células estromais mesenquimais de cordão umbilical (UC-MSC) expandidas em biorreator de tanque agitado, sob condições livre de xenoantígenos, pré-condicionadas ou não com hipóxia e/ou interleucina-17 (IL-17). Primeiramente, foi estabelecido um protocolo de expansão de UC-MSC em sistema de cultivo 3D, escalonável e livre de xenoantígenos, podendo ser concomitantemente pré-condicionadas. Os resultados demonstraram UC-MSC expandem eficientemente por cinco dias em sistema 3D agitado em condições de normóxia ou hipóxia usando microcarregadores revestidos de colágeno humano e meio suplementado com soro AB humano. UC-MSC expandidas em sistema de cultivo 3D agitado e condição de hipóxia mantiveram o imunofenótipo, potencial de diferenciação e potencial imunossupressor in vitro característicos de MSC, comparadas às condições controles. Notavelmente, esta condição de cultivo aumentou significativamente as propriedades angiogênicas in vitro das UC-MSC. Em seguida, os efeitos dos pré-condicionamentos das UC-MSC com IL-17 combinado ou não com hipóxia foi avaliado. UC-MSC pré-condicionadas com IL-17 e hipóxia apresentaram maior capacidade imunossupressora in vitro, comparadas às outras condições, porém sem diferença estatística. O pré-condicionamento das UC-MSC com IL-17 em condição de normóxia aumentou significativamente a secreção de CD147, molécula com funções imunossupressoras. O secretoma das UC-MSC expandidas em sistema de cultivo 3D agitado e pré-condicionadas em condições de hipóxia apresentou grande número de proteínas pró-angiogênicas, anti-angiogênicas, citocinas pró-inflamatórias e pró-inflamatórias, fatores de crescimento, dentre outras. Por outro lado, o secretoma das UC-MSC expandidas da mesma forma, porém pré-condicionadas com IL-17/normóxia e IL-17/hipóxia apresentou uma significativa diminuição do número e/ou concentração de proteínas bioativas secretadas. Por fim, os resultados mostraram que UC-MSC expandidas em sistema de cultivo 3D em biorreator de tanque agitado, independente do pré-condicionamento, apresentam concomitantemente "assinatura angiogênica" pela secreção de VEGF e TGF-β e "assinatura imunossupressora" pela secreção de PGE-2 e IDO, evidenciadas também pelos ensaios funcionais de angiogênese e inibição da proliferação de linfócitos, respectivamente.

Mesenchymal stromal cells (MSC) have been used in the treatment of a variety of diseases due to their remarkable regenerative, immunosuppressive, and immunomodulatory potential. However, many clinical studies have revealed limited results, which have led researchers to search for strategies to improve their therapeutic efficacy. Importantly, the clinical application of MSC requires the implementation of scalable cell expansion bioprocesses combined with xenoantigen-free culture conditions. The general objective of this work was to characterize and functionally evaluate umbilical cord mesenchymal stromal cells (UC-MSC) expanded in a stirred tank bioreactor, under xenoantigen-free conditions, preconditioned or not with hypoxia and/or interleukin-17 (IL-17). Firstly, a UC-MSC expansion protocol was established in a scalable, xenoantigen-free, agitated 3D culture system, in which cells can be preconditioned at the same time. The results demonstrated that UC-MSC efficiently expands for five days in a stirred 3D culture system under conditions of normoxia or hypoxia using microcarriers coated with human collagen and medium supplemented with human AB serum. Expanded UC-MSC in a stirred 3D culture system, under hypoxia condition, maintained the immunophenotype, differentiation potential and in vitro immunosuppressive potential characteristic of MSC, compared to control conditions. Notably, this culture condition significantly increased the in vitro angiogenic properties of UC-MSC. Next, the effects of UC-MSC preconditioning with IL-17 combined or not with hypoxia was evaluated. UC-MSC preconditioned with IL-17 and hypoxia showed greater in vitro immunosuppressive capacity, compared to other conditions, but without statistical differences. The preconditioning of UC-MSC with IL-17 under normoxia significantly increased the secretion of CD147, a molecule with immunosuppressive functions. The secretome of UC-MSC expanded in stirred 3D culture system and preconditioned under hypoxic conditions presented a large number of pro-angiogenic, anti-angiogenic, pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines, growth factors, among others. On the other hand, the secretome of UC-MSC expanded in the same way but preconditioned with IL-17/normoxia and IL-17/hypoxia presented a significant decrease in the number and/or concentration of secreted bioactive proteins. Finally, our results showed that UC-MSC expanded in stirred 3D culture system, independent of preconditioning, presented concomitantly "angiogenic signature" by the secretion of VEGF and TGF-β and "immunosuppressive signature" by the secretion of PGE-2 and IDO, also evidenced by functional assays of angiogenesis and inhibition of lymphocyte proliferation, respectively.