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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2021.tde-26112021-161533
Documento
Autor
Nome completo
Luciana Silva de Araújo
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2021
Orientador
Banca examinadora
Furtado, Niege Araçari Jacometti Cardoso (Presidente)
Borin, Maria de Fátima
Pereira, Marita Gimenez
Título em português
Impacto das condições de cultura de células Caco-2 na avaliação da permeabilidade intestinal do biomarcador ácido ent-poliáltico da oleorresina de Copaifera duckei
Palavras-chave em português
Ácido ent-poliáltico
Células Caco-2
Probiótico
Resumo em português
O biomarcador ácido ent-poliáltico (AP) da oleorresina de Copaifera duckei possui várias atividades biológicas reportadas. No entanto, para que um composto seja um produto oral bem-sucedido, não deve ser somente farmacologicamente ativo, mas também deve ter características de permeabilidade intestinal razoáveis. A monocamada de células Caco-2 é um modelo in vitro amplamente aceito para prever a permeabilidade intestinal, mas possui variabilidade intrínseca ao método, levando a alta variabilidade em seu desempenho. Portanto, o objetivo do presente estudo foi determinar a influência do uso de agitação no sistema, e da presença de probiótico na permeabilidade intestinal do AP. Os procedimentos experimentais para a avaliação da permeabilidade intestinal foram divididos em algumas etapas principais: avaliação da viabilidade celular; determinação da concentração inibitória mínima do AP sobre Lactobacillus fermentum; padronização das condições de cocultivo; medida da resistência elétrica transepitelial (RET) durante o crescimento até 20 dias; e determinação das permeabilidades apical-basolateral (AB) e basolateral-apical (B-A) por 4 h. O controle foi realizado com os compostos atenolol (AT) e propranolol (PROP), que são os marcadores de transporte transcelular para uma baixa e alta permeabilidade, respectivamente. Os estudos de viabilidade celular indicaram que o AP não era tóxico para as células Caco-2 a 12,5 µM, além disso, essa concentração não inibiu o crescimento de L. fermentum. AT e PROP não inibiram o crescimento de L. fermentum e não foram tóxicos para as células Caco-2 a 10 µM e 5 µM, respectivamente. O meio de cultivo padronizado para o experimento com a cocultura foi o meio de Eagle modificado por Dulbecco, sem antibióticos e sem soro fetal bovino. As propriedades da barreira foram consideradas aceitáveis para a RET ≥ 300 Ω.cm2 em todos os experimentos, e L. fermentum induziu um aumento significativo (p < 0,05) na RET após 24 h. Considerando a classificação que foi reportada na literatura, o AP apresentou permeabilidade moderada através dos enterócitos em todas as condições de cultivo avaliadas, não ocorrendo transporte reverso. A permeabilidade aparente (Papp) do AP no experimento sob agitação (2,83 ± 0,58 x 10-6 cm/s) apresentou diferença significativa em relação ao experimento sem agitação, e os valores obtidos nos experimentos de cocultivo não foram estatisticamente significativos em relação ao experimento sem agitação. Portanto, foi demonstrado que as condições de cultivo podem influenciar as propriedades de barreira da monocamada Caco-2, bem como a permeabilidade do AP.
Título em inglês
Impact of Caco-2 cell culture conditions on the evaluation of intestinal permeability of the biomarker ent-polyaltic acid from Copaifera duckei oleoresin
Palavras-chave em inglês
Caco-2 cells
Ent-polyalthic acid
Probiotic
Resumo em inglês
The ent-polyalthic acid (AP) biomarker of Copaifera duckei oleoresin has several reported biological activities. However, for a compound to be a successful oral product, it must not only be pharmacologically active, but it must also have reasonable intestinal permeability characteristics. The Caco-2 cell monolayer is a widely accepted in vitro model to predict intestinal permeability, but it has inherent variability in the method, leading to high variability in its performance. Therefore, the aim of this study was to determine the influence of use of agitation in the system, and presence of probiotics on intestinal permeability of the AP. The experimental procedures for the assessment of intestinal permeability were divided into some main steps: assessment of cell viability; determination of the minimum inhibitory concentration of AP on Lactobacillus fermentum; standardization of co-cultivation conditions; measurement of transepithelial electrical resistance (RET) during growth up to 20 days; and determination of apical-basolateral (AB) and basolateral-apical (B-A) permeabilities for 4 h. The control was performed with the compounds atenolol (AT) and propranolol (PROP), which are transcellular transport markers for low and high permeability, respectively. Cell viability studies indicated that AP was not toxic to Caco-2 cells at 12.5 µM, in addition, this concentration did not inhibit the growth of L. fermentum. AT and PROP did not inhibit the growth of L. fermentum and were not toxic to Caco-2 cells at 10 µM and 5 µM, respectively. The standardized culture medium for the coculture experiment was Dulbecco's modified Eagle's medium, without antibiotics and without fetal bovine serum. Barrier properties were considered acceptable for RET ≥ 300 Ω.cm2 in all experiments, and L. fermentum induced a significant increase in RET after 24 h. Considering the classification reported in the literature, AP presented moderate permeability through enterocytes in all culture conditions evaluated, no reverse transport. The apparent permeability (Papp) of the AP in the experiment under agitation (2.83 ± 0.58 x 10-6 cm/s) showed a significant difference in relation to the experiment without agitation, and the values obtained in the co-cultivation experiments were not statistically significant in relation to the experiment without agitation. Therefore, it was demonstrated that the growing conditions can influence the barrier properties of the Caco-2 monolayer, as well as permeability of the AP.
 
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Data de Liberação
2023-09-27
Data de Publicação
2022-01-06
 
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