A flavoenzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) catalisa a quarta reação da via de novo de biossíntese de pirimidinas, se destacando como alvo molecular chave para parasitos causadores de Doenças Negligenciadas (DNs). Tendo em vista a demanda por novas alternativas terapêuticas para estas doenças, o objetivo deste trabalho foi a triagem in vitro de inibidores da enzima DHODH de Leishmania major (LmDHODH) em Asteraceae. Esta triagem foi acompanhada por abordagem metabolômica em UHPLC-ESI-HRFTMS para os extratos vegetais e estudos de QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationships) para as substâncias isoladas. As etapas experimentais realizadas e os resultados obtidos foram: 1) Ensaios enzimáticos: os valores de IC50 foram determinados para 59 extratos (?IC50: 148,0 ?g.mL-1 a 9,4 mg.mL-1) e 57 substâncias isoladas (?IC50: 27,0 ?M a 2,6 mM). As substâncias mais ativas frente à LmDHODH apresentaram seletividade, ao exercer inibição irrelevante sobre DHODH humana. Adicionalmente, estudos de termoestabilidade confirmaram que as lactonas sesquiterpênicas (STLs) são, de fato, capazes de se ligar a esta enzima; 2) Estudos metabolômicos: as impressões digitais metabólicas por LC-MS foram obtidas com sucesso para os 59 extratos e o processamento dos dados forneceu 3.694 substâncias. A desreplicação por meio de uma biblioteca de padrões identificou com segurança 49 metabólitos secundários. Por meio da correlação in silico com os dados de inibição enzimática, foram determinados com êxito os principais biomarcadores dos extratos e obteve-se um modelo de regressão confiável para predição do potencial de inibição de novos extratos provindos de espécies ainda não testadas frente à LmDHODH, classificando-os como ativos ou inativos com base exclusivamente na sua impressão digital por UHPLC-ESI-HRFTMS; 3) Estudos de QSAR com 21 STLs: o modelo de QSAR baseado em descritores moleculares apresentou robustez e confiabilidade (R2 / Q2 / P2 > 0,6 e RMSE < 0,3), revelando que uma maior inibição desta enzima requer a distribuição balanceada das regiões hidrofóbicas através da superfície molecular, maior largura das moléculas e menor hidrofobicidade. O modelo 3D baseado em descritores farmacofóricos também foi útil (R2: 0,79; Q2: 0,55) e confirmou a importância da orientação adequada dos ligantes, propriedades superficiais e formato das moléculas, refletindo propriedades de um possível sítio de ligação para as STLs na enzima. Portanto, alguns dos produtos naturais testados nesta triagem in vitro são, de fato, capazes de inibir seletivamente a enzima LmDHODH, tratando-se de uma descoberta relevante, visto que uma infinidade de metabólitos secundários leishmanicidas já foram descritos, porém, para a maioria deles, o mecanismo de ação segue desconhecido. Os resultados evidenciaram (1) as espécies de Asteraceae como importante fonte na busca por novos inibidores desta enzima e (2) as substâncias mais ativas como ponto de partida para novas estruturas guias (lead compounds) visando novos fármacos antiparasitários para o tratamento de DNs, especialmente a leishmaniose.

The flavoenzyme dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) catalyzes the fourth reaction of the de novo pyrimidine biosynthetic pathway, standing out as a key molecular target for trypanosomatid parasites causing Neglected Diseases (NDs). In view of the global demand for new therapies for such diseases, this study aimed for the in vitro screening of inhibitors of Leishmania major DHODH (LmDHODH) in Asteraceae, accompanied by metabolomic approach with UHPLC-ESI-HRFTMS for plant extracts and QSAR studies (Quantitative Structure-Activity Relationships) for isolated compounds. The experimental steps performed and the results obtained were: 1) Enzymatic assays: the IC50 values were determined for 59 plant extracts (?IC50: 148.0 ?g.mL-1 a 9.4 mg.mL-1) and 57 natural compounds (?IC50: 27.0 ?M a 2.6 mM). The most active compounds showed selectivity against LmDHODH by exercising irrelevant inhibition of human DHODH. In addition, thermostability studies have confirmed that sesquiterpene lactones (STLs) are indeed capable of binding to this enzyme; 2) Metabolomic studies: the metabolic fingerprints by LC-MS were successfully obtained for the 59 extracts and 3,694 peaks/compounds were provided after data processing. The dereplication using a library of natural compounds has safely identified 49 secondary metabolites. By means of in silico correlation with the enzymatic inhibition data, the main biomarkers of the extracts were successfully determined and a reliable regression model was obtained to predict the inhibition potential of new extracts from species not yet tested against LmDHODH, classifying it as active or inactive based solely on their fingerprint by UHPLC-ESI-HRFTMS; 3) QSAR studies with 21 STLs: a reliable QSAR model based on molecular descriptors was obtained (R2 / Q2 / P2 > 0.6 and RMSE < 0.3), which indicated that stronger inhibition requires a balanced distribution of the hydrophobic regions across the molecular surface, as well as higher width and lower hydrophobicity of the molecules. A pharmacophore-based 3D-QSAR approach also afforded a useful model (R2: 0.79; Q2: 0.55), which confirmed the importance of proper orientation of the ligands, molecular surface features and shape for stronger inhibition, reflecting properties of a putative common binding site. Thus, some of the natural products tested in this in vitro screening are actually capable of selectively inhibiting LmDHODH. This constitutes a relevant finding, since an infinity of leishmanicidal compounds have been described, however, for most of them, the mechanism of action remains unknown. The results highlighted (1) Asteraceae species as important sources of new LmDHODH inhibitors and (2) the most active metabolites as promising starting points for new led compounds aiming new antiparasitc drugs for treatment of NDs caused by trypanosomatids, especially leishmaniasis.