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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2021.tde-27092021-152105
Documento
Autor
Nome completo
Angelo Luis Caron
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2021
Orientador
Banca examinadora
Bentley, Maria Vitoria Lopes Badra (Presidente)
Moraes, Ângela Maria
Ramos, Ana Paula
Yagui, Carlota de Oliveira Rangel
Título em português
Desenvolvimento de sistemas lipossomais para a liberação da alfa-glicosidase como proposta para a terapia da doença de Pompe
Palavras-chave em português
Anti-receptor de insulina
Doença de Pompe
Lipossomas
Resumo em português
A doença de Pompe é causado pela deficiência da enzima lisossomal α-glicosidase ácida (GAA) resultando em acúmulo de glicogênio nas células. Os principais tecidos atingidos são o cardíaco, os musculares e o nervoso. O espectro clínico compreende uma forma infantil, mais severa com alta morbilidade e mortalidade, e uma tardia, com progressão mais lenta, que resulta em fraqueza muscular e insuficiência respiratória. A terapia atualmente disponível consiste na reposição enzimática com uma enzima recombinante e representou uma melhora significativa da expectativa de vida dos pacientes. Apesar disso, alguns fatores ainda limitam seus benefícios, como a baixa biodisponibilidade e absorção da enzima livre pelas células alvo, não interrompendo a progressão da doença. Dessa forma, o uso da nanotecnologia no desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos surge como uma alternativa para superar as dificuldades da aplicação da enzima livre na circulação sanguínea. Entre os sistemas disponíveis, os lipossomas representam uma tecnologia avançada de carreamento de moléculas ativas. Os lipossomas são estruturas vesiculares fosfolipídicas biocompatíveis e biodegradáveis que permitem a entrega de agentes terapêuticos para o interior das células ou compartimentos celulares. O revestimento da superfície lipossomal com componentes hidrofílicos, como o polietilenoglicol (PEG), aumenta significativamente seu tempo de circulação. Ainda, ligantes específicos, como anticorpos, têm sido incorporados na superfície desses lipossomas buscando o direcionamento ativo para um local alvo. Com isso, o uso de um carreador lipossomal de longa circulação e funcionalizado com o anticorpo para o receptor de insulina humana representa uma proposta inovadora para otimizar a distribuição da enzima da GAA para os tecidos alvos, diminuindo a dose terapêutica necessária e superando as atuais barreiras para um tratamento adequado da doença de Pompe. No presente trabalho, foram padronizadas condições experimentais para obtenção de lipossomas peguilados contendo a enzima GAA. Os sistemas obtidos apresentaram tamanho em torno de 135 nm com uma polidispersividade de 0,144, potencial zeta de -25,2 mV e eficiência de encapsulamento de 90% para a GAA. Os ensaios de atividade enzimática demonstraram a estabilidade da enzima durante o processo de obtenção dos lipossomas. A funcionalização da superfície dos sistemas com anticorpo para o receptor de insulina apresentou eficiência de 90%. Com isso, demonstramos que a GAA pode ser encapsulada em um sistema lipossomal peguilado, com tamanho e distribuição de tamanho adequadas para aplicação endovenosa. Os ensaios de citometria de fluxo e microscopia confocal demonstraram que as formulações funcionalizadas são capazes de adentrar a célula e entregar a enzima no interior dos lisossomos com maior eficiência. Dessa forma, a futura aplicação de lipossomas direcionados para o receptor de insulina apresenta perspectivas de diminuição da dose terapêutica da GAA e a superação de importantes barreiras biológicas para o tratamento adequado da doença de Pompe.
Título em inglês
Development of a liposomal system for delivery of the acid alphaglucosidase as a proposition for therapy of the Pompe disease
Palavras-chave em inglês
Insulin receptor
Liposome
Pompe disease
Resumo em inglês
Pompe disease is a rare autosomal recessive lysosomal storage disease caused by deficiency of the enzyme acid-alfa-glucosidase (GAA), resulting in glycogen accumulation in the lysosomes of cardiac muscle, skeletal muscle, and motor neurons, which ultimately results in cardiorespiratory failure. The only therapy clinically available is the enzyme replacement therapy (ERT). However, the low availability and poor uptake of the recombinant enzyme by the target cells still limits the benefits of the treatment. In this scenario the development of drug carrier systems emerges as an alternative to overcome these problems. Liposomes coated with hydrophilic polymer, such as PEG (polyethylene glycol) represents an advanced technology to deliver therapeutic agents to a target site. In the present study we developed a liposomal formulation encapsulating the GAA enzyme and functionalized with the anti-insulin receptor. Liposomes composed of DPSC, Cholesterol, DSPE-PEG and DSPE-PEGmaleimide were prepared by thin-film hydration method followed by extrusion in 100 nm polycarbonate membranes. The best parameters of lipid concentration, velocity of rotation of the flask in the evaporation and hydration phase and number of extrusion cycles were determined by a Box-Behnken design. Liposomes were characterized for size, polydispersity (PDI), zeta potential, stability, concentration and efficiency of the encapsulation of the GAA. Also, the enzyme had its activity assessed during all stages of liposome production. After preparing 15 different formulations of liposomes, we were able to establish the best parameters of liposome production. The resulting formulation showed a medium size of 135.2nm, a PDI of 0.144 and zeta potential of -25.2mV. There was no difference in size and PDI when encapsulating the enzyme. Also, we accessed the levels of activity of the enzyme during hydration and extrusion and there was no loss of activity when compared to optimal conditions. The formulations were found to be stable for at least a month when stored at 4°C and 37°C. The efficiency of encapsulation of the GAA was indirectly and directly measured by Bradford protein assay and showed an efficiency of around 90% by both methods. We demonstrated by flow cytometry that the liposomes were efficiently internalized by endothelial cells and that the pre-treatment with insulin significantly reduce uptake of anti-insulin receptor coated liposomes. Moreover, confocal microscopy image analysis demonstrated that anti-insulin receptor coated liposomes have a higher colocalization with a specific lysosomal marker when compared to plain liposomes. The use of nanotechnology is an interesting strategy to overcome the barriers of a successful ERT for lysosomal storage disorders. Here, we presented a stable pegylated liposome with characteristics suitable for an intravenous application. The efficient encapsulation of the GAA enzyme demonstrate the possible application of a liposomal system in the pursuit of an adequate treatment of Pompe disease.
 
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Tese_Corrigida.pdf (1.05 Mbytes)
Data de Liberação
2023-06-10
Data de Publicação
2021-09-28
 
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