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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2019.tde-24032022-153744
Document
Auteur
Nom complet
Danielle Nishida Ramos Shikida
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2019
Directeur
Jury
Lopez, Renata Fonseca Vianna (Président)
Cordeiro, Lorena Rigo Gaspar
Herculano, Rondinelli Donizetti
Pellosi, Diogo Silva
Ramos, Ana Paula
Titre en portugais
Desenvolvimento de sistemas de liberação compostos pelo conjugado quitosana-arginina visando o tratamento tópico de feridas
Mots-clés en portugais
Cicatrização
Conjugado quitosana-arginina
Nanopartícula
Sistema de liberação
Tratamento tópico
Resumé en portugais
A arginina é um aminoácido condicionalmente essencial no processo de cicatrização. Catabolizada pela óxido nítrico sintase e arginases, a arginina é rapidamente depletada durante o processo de cicatrização de feridas crônicas, dificultando a síntese de colágeno e outras proteínas que contribuem para a regeneração tecidual. A administração de arginina no local da ferida pode compensar sua deficiência. Para evitar seu rápido metabolismo e promover a liberação sustentada, neste trabalho a arginina foi conjugada à quitosana (CHITARG) e este polímero foi utilizado para a preparação de nanopartículas (NPCHITARG). O potencial de NP-CHITARG para encapsular a arginina foi investigada. O conjugado CHITARG foi caracterizado por RMN, TGA, DSC e morfologia por MEV. NPCHITARG, obtida por um método de nanoprecipitação, foi caracterizada em termos de tamanho, polidispersidade, potencial zeta, morfologia e eficiência de encapsulação da arginina. Para fins de comparação, nanopartículas preparadas com quitosana (NP-CHIT) também foram avaliadas. A citotoxicidade das NP-CHITARG foi investigada em cultura de fibroblastos. Por fim, estudos in vivo em feridas induzidas em ratos Wistar Hannover foram realizados com as formulações espessadas com hidroxietilcelulose (HEC). Neles foram investigados o índice de cicatrização (IC), níveis das enzimas mieloperoxidase (MPO) e N-acetil-β-D-glicosaminidase (NAG) e nível de hidroxiprolina nas feridas após 3, 10 e 20 dias do tratamento. NP-CHIT e NP-CHITARG apresentaram tamanho nanométrico, 57 e 56nm, respectivamente, potencial zeta positivo e pH 6. A adição de arginina a quitosana ou as dispersões de CHITARG aumentou aproximadamente 2 vezes o tamanho das nanopartículas e diminuiu o pH das dispersões para 5,5, no caso da NP-CHITARG, e para 5,0, no caso da NP-CHIT. NP-CHITARG foi capaz de encapsular cerca de 36% de arginina a partir da concentração inicial de 10 mg. A eficiência de encapsulação da NP-CHIT, por outro lado, foi de 13%. A redispersão das nanopartículas em água mantiveram a arginina encapsulada, com apenas 9,1 e 1,6% de liberação, a partir da NP-CHIT e da NP-CHITARG, respectivamente, imediatamente após a redispersão. As dispersões mantiveram-se estáveis, sem liberação de arginina excedente, por até 48h. As nanopartículas não foram citotóxicas para os fibroblastos. In vivo, todas as feridas cicatrizaram após 20 dias de tratamento, inclusive aquelas tratadas com a formulação controle negativo (composta apenas por HEC), apresentando todas ICs semelhantes. As análises bioquímicas mostraram, no entanto, diferenças no padrão de cicatrização. As amostras de pele tratadas com as NP-CHITARG, contendo ou não arginina, apresentaram níveis de MPO semelhantes ao presente na pele íntegra (sem ferida), o que não ocorreu com as formulações que não continham nanopartículas e nem com a NP-CHIT. Os níveis de NAG, por sua vez, mantiveram-se semelhantes aos da pele íntegra apenas quando as feridas foram tratadas com a NP-CHITARG que continha arginina encapsulada. Esse tratamento também resultou, após 20 dias, em níveis de hidroxiprolina semelhantes ao presente na pele sem ferida. Desta forma, foi possível sintetizar o conjugado CHITARG, preparar nanopartículas a partir dele e encapsular a arginina. O tratamento das feridas com as NPCHITARG, principalmente com a NP-CHITARG contendo arginina, parecem ter evitado um processo inflamatório acentuado durante o processo de cicatrização. Mais ainda, esse tratamento possibilitou o fechamento da ferida e deu origem a um tecido com conteúdo de colágeno semelhante aquele presente na pele íntegra.
Titre en anglais
Development of arginine delivery systems composed of chitosan-arginine conjugate aiming topical treatment of wounds
Mots-clés en anglais
Arginine-conjugated chitosan
Healing
Nanoparticle
Release system
Topical treatment
Resumé en anglais
Arginine is a conditionally essential amino acid in the healing process. Catabolized by nitric oxide synthase and arginases, arginine is rapidly depleted during the healing process of chronic wounds, hampering the synthesis of collagen and other proteins that contribute to tissue regeneration. The administration of arginine at the wound site can compensate for its deficiency. To avoid its rapid metabolism and promote sustained release, in this work arginine was conjugated to chitosan (CHITARG) and this polymer was used for the preparation of nanoparticles (NP-CHITARG). The potential of NP-CHITARG to encapsulate arginine was investigated. The CHITARG conjugate was characterized by NMR, TGA, DSC and morphology by MEV. NP-CHITARG, obtained by a modified nanoprecipitation method, was characterized in terms of size, polydispersity, zeta potential, morphology and encapsulation efficiency of arginine. For comparison purposes, nanoparticles prepared with chitosan (NP-CHIT) were also evaluated. The cytotoxicity of NP-CHITARG was investigated in culture of fibroblasts. Finally, in vivo studies on wounds induced in Wistar Hannover rats were performed with the formulations thickened with hydroxyethylcellulose (HEC). In these studies, the healing rate (HR), myeloperoxidase (MPO), N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAG) and hydroxyproline levels in the wounds were investigated after 3, 10 and 20 days of treatment. NP-CHIT and NP-CHITARG showed nanometric size, 57 and 56 nm, respectively, positive zeta potential and pH 6. Addition of arginine to polymers dispersions increased about 2-fold the size of the nanoparticles and decreased the pH of the dispersions to 5.5, in the case of NP-CHITARG, and to 5.0, in the case of NP-CHIT. NP-CHITARG was able to encapsulate about 36% of arginine from the initial concentration of 10 mg. The NPCHIT encapsulation efficiency, on the other hand, was 13%. Redispersion of the nanoparticles in water maintained arginine encapsulated, with only 9.1 and 1.6% release, from NP-CHIT and NP-CHITARG, respectively, immediately after redispersion. The dispersions remained stable, with no release of excess arginine, for up to 48h. Nanoparticles were not cytotoxic to fibroblasts. In vivo, all wounds healed after 20 days of treatment, including those treated with the negative control formulation (composed only by HEC), showing all similar HR. The biochemical analyzes showed, however, differences in the pattern of healing. Skin samples treated with NP-CHITARG, containing or not arginine, showed levels of MPO similar to that present in intact skin (without wound), which did not occur with the formulations that did not contain nanoparticles nor with the NP-CHIT. NAG levels remained similar to present in intact skin only when wounds were treated with arginine-loaded NP-CHITARG. This treatment also resulted, after 20 days, in hydroxyproline levels similar to the one present on the skin without wound. In conclusion, it was possible to synthesize the CHITARG conjugate, prepare nanoparticles from it and encapsulate arginine. The treatment of wounds with NP-CHITARG, especially with arginine-loaded NP-CHITARG, seems to avoid an accentuated inflammatory process during the wound healing. Furthermore, it allowed the wound to close and gave rise to a tissue with similar collagen content of that present in the healthy skin.
 
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Date de Libération
2021-09-03
Date de Publication
2022-04-12
 
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