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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2020.tde-21092021-055327
Documento
Autor
Nombre completo
Renata Spagolla Napoleão Tavares
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2020
Director
Tribunal
Cordeiro, Lorena Rigo Gaspar (Presidente)
Dorta, Daniel Junqueira
Granjeiro, Jose Mauro
Valadares, Marize Campos
Título en portugués
Avaliação da toxicidade e eficácia de ingredientes de uso tópico por métodos alternativos in vitro: culturas 2D, 3D e microfluídica de orgãos-em-chip
Palabras clave en portugués
Citotoxicidade
Esferoide de fígado
Fototoxicidade
Irritação
Métodos alternativos in vitro
Microfluídica
Modelo de pele humana
Órgãos em chip
Resumen en portugués
Os ensaios in vitro são aceitos como alternativos à experimentação animal, apenas se apresentarem alta reprodutibilidade e relevância para predizer a toxicidade em seres humanos. Assim, novas tecnologias, tais como tecidos tridimensionais (3D) foram desenvolvidas para preencher a lacuna entre os modelos in vitro bidimensionais (2D) e melhorar a correlação com os humanos. Mais recentemente, os sistemas microfluídicos órgãos-em-chip, que emulam a fisiologia do ambiente in vivo por permitirem a inclusão de diferentes organoides em um mesmo meio circulante, possuem maior potencial preditivo em relação à toxicidade humana e podem ser utilizadas durante a triagem de substâncias desconhecidas. O objetivo principal deste trabalho foi desenvolver e comparar a capacidade de sistemas in vitro de diferentes complexidades: culturas 2D, pele 3D cultivada de modo estático ou em microfluídica associada ao modelo de fígado, em predizer a toxicidade e eficácia das substâncias teste. Para tal, foi desenvolvido um modelo de pele - Reconstructed Human Skin (RHS). Na primeira abordagem, o modelo RHS foi aplicado para a avaliação da fototoxicidade e da atividade antioxidante da fucoxantina, isolada de alga antártica e com um conhecido potencial antioxidante nunca testado na pele humana. A fucoxantina se mostrou fototóxica em monocamadas e fotoinstável, porém quando adicionada em fotoprotetor se mostrou fotoestável. A fucoxantina não foi considerada fototóxica em modelo de pele, demonstrando a importância da presença do estrato córneo para confirmar a toxicidade de compostos desconhecidos. Ainda, se mostrou capaz de inibir as espécies reativas do oxigênio (ERO) de maneira significativa tanto em monocamadas quanto em modelo de pele, mostrando que mesmo em baixas concentrações, exerce efeito protetor contra ERO gerados pela radiação UVA. A etapa seguinte, o RHS foi miniaturizado para adequação em sistema de órgãos-em-chip e o RHS reduzido foi utilizado no ensaio de irritação cutânea da fucoxantina (OECD TG 439). Novas análises foram incluídas em paralelo para a identificação de novos biomarcadores da irritação nos tecidos; o controle positivo lauril sulfato de sódio (LSS) foi considerado irritante e a fucoxantina não; entretanto, a fucoxantina reduziu a expressão de gênica de interleucinas pró-inflamatórias (IL-6 e IL-8) quando no veículo etanol, e aumentou a expressão de NAT1, indicando sua metabolização pela pele e efeito protetor aos efeitos deletérios do etanol. Na terceira abordagem, ensaio de irritação cutânea do RHS reduzido foi avaliado tanto em cultivo estático, quanto dinâmico, para tal, o fármaco de escolha foi o antifúngico terbinafina, por se acumular na pele humana e ter potencial hepatotóxico em terapias de longo prazo. No modelo dinâmico, o RHS foi associado a modelo de fígado e o sistema foi chamado de Chip2. Tanto no RHS estático quanto no Chip2 a terbinafina não foi considerada irritante enquanto que o controle positivo LSS foi o único considerado irritante, por meio dos resultados metabólicos, de liberação de IL-6 e ainda pela análise de viabilidade celular por LDH e MTT (nos tecidos estáticos). Demonstrou também efeitos deletérios nos esferoides de fígado, mostrando ter atravessado o modelo de RHS. Entretanto, no RHS a concentração tópica de terbinafina a 5% no Chip2 aumentou a expressão de IL-1α e ainda aumentou células apoptóticas e diminuiu as proliferativas nos esferoides de fígado, aumentando também a expressão das enzimas hepáticas CYP1A2 e CYP3A4, o que prova que também atravessou o RHS para exercer os efeitos ii observados no fígado. A aplicação sistêmica de 0,1% de terbinafina aumentou a expressão de EGFR apenas no RHS do Chip2 e aumentou as células apoptóticas no fígado, além de regular negativamente a albumina e regular positivamente CYP2C9, agindo como um controle hepatotóxico de terbinafina. A combinação de RHS e fígado no Chip2 em microfluídica permitiu uma resposta mais sensível do RHS observado apenas pela expressão gênica e permitiu a avaliação de efeitos hepáticos causados pelas substâncias capazes de atravessar o RHS. Em conclusão, o aumento da complexidade dos ensaios in vitro desenvolvidos no presente trabalho abrem novas perspectivas para a avaliação da toxicidade e da eficácia de substâncias teste, com o potencial para melhorar a predição dos estudos pré-clínicos.
Título en inglés
Toxicity assessment of topical ingredients by in vitro alternative methods: 2D, 3D and microfluidic (Organ-on-a-chip) cultures
Palabras clave en inglés
Alternative methods
Cytotoxicity
Human skin model
In vitro
Irritation
Liver spheroid
Microfluidics
Two organs-on-a-chip
Resumen en inglés
In vitro tests are accepted as alternatives to animal experimentation, only if they have high reproducibility and relevance for predicting toxicity in humans. Thus, new technologies such as three-dimensional (3D) reconstructed tissues have been developed to fill the gap between two-dimensional (2D) in vitro models and improve the correlation with humans. More recently, microfluidic organ-on-a-chip systems, which emulate the physiology of the in vivo environment by allowing the inclusion of different organoids in the same circulating medium, have greater predictive potential for human toxicity and can be used during the screening of unknown substances. The objective of this study was to develop and compare the capacity of in vitro systems of different complexities: 2D cultures, 3D skin cultivated in a static way or in microfluidic associated to a liver model, to predict the toxicity and efficacy of the test substances, following established protocols and internationally recommended. To this end, a reconstructed human skin (RHS) was developed In the first approach, the RHS model was applied for the evaluation of phototoxicity and antioxidant activity of fucoxanthin, isolated from Antarctic algae, with promising antioxidant activity never tested in the human skin. Fucoxanthin was shown to be phototoxic in the monolayer assay and photo unstable, but when added in a sunscreen it was shown to be photostable. Fucoxanthin was not considered phototoxic in the RHS, demonstrating the importance of the stratum corneum to confirm the toxicity of unknown compounds. It was also shown to inhibit reactive oxygen species (ROS) significantly in both monolayers and RHS, demonstrating that even at low concentrations it exerts a protective effect against ROS generated by UVA radiation. The next step, RHS was miniaturized for adaptation in an organ-chip system and the reduced RHS was used in the fucoxanthin skin irritation test (OECD TG 439). New analyses were included in parallel for the identification of new biomarkers of tissue irritation; the positive control of sodium lauryl sulfate (LSS) was considered irritant and fucoxanthin was not; however, fucoxanthin reduced the gene expression of pro-inflammatory interleukins (IL-6 and IL-8) when in the ethanol vehicle, and increased the expression of NAT1, indicating its metabolization by the skin and protective effect to the deleterious effects of ethanol. In the third approach, the reduced RHS skin irritation test was evaluated both in static and dynamic culture, for which the drug of choice was the antifungal terbinafine, as it accumulates in human skin and has hepatotoxic potential in long-term therapies. In the dynamic model, RHS was associated with the liver model and the system was called Chip2. In both static RHS and Chip2, terbinafine was not considered irritant, while the LSS positive control was the only one considered irritant, through metabolic results, IL-6 release and also through cell viability analysis by LDH and MTT (in static tissues). It also demonstrated deleterious effects on liver spheroids, showing to have passed through the RHS model. However, in RHS the topical concentration of 5% terbinafine in Chip2 increased IL-1α expression; in liver spheroids it increased apoptotic cells and decreased proliferative cells, and also increased CYP1A2 and CYP3A4 enzyme expression, proving that it also passed through RHS to exert the effects observed in the liver. The systemic application of terbinafine of 0.1% increased EGFR expression only in the RHS of Chip2 and increased the apoptotic cells in the liver, in addition to iv regulating albumin negatively and regulating CYP2C9 positively, acting as a hepatotoxic control of terbinafine. The combination of RHS and liver on Chip2 in microfluidics allowed a more sensitive response of RHS observed only by gene expression and allowed the evaluation of liver effects caused by substances capable of passing through RHS. In conclusion, the increased complexity of the in vitro tests developed in this work opens new perspectives for the evaluation of the toxicity and efficacy of test substances, with the potential to improve the prediction of preclinical studies.
 
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Fecha de Liberación
2022-05-27
Fecha de Publicación
2021-09-28
 
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