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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2022.tde-18082022-161940
Document
Author
Full name
Ivana Pereira Santos Carvalho
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2022
Supervisor
Committee
Gaspari, Priscyla Daniely Marcato (President)
Chacra, Nádia Araci Bou
Castro, Fabíola Attié de
Santos, Aline Martins dos
Title in Portuguese
Desenvolvimento, caracterização e atividade antitumoral de nanocarreador híbrido com extrato alcaloídico de Solanum lycocarpum
Keywords in Portuguese
Câncer de bexiga
Citotoxidade
Extrato alcaloídico
Nanopartícula híbrida
Quitosana
Solanum lycocarpum
Abstract in Portuguese
Solanum lycocarpum é uma espécie do cerrado brasileiro conhecida por sua diversidade em glicoalcalóides (GA). Os GA, solasonina (SS) e solamargina (SM), extraídos dos frutos desta planta, apresentam propriedades antitumorais. No entanto, a baixa solubilidade em água destas moléculas e a sua toxicidade limita a aplicação destes GA. O desenvolvimento de uma formulação nanoestruturada contendo GA poderá melhorar a ação antitumoral dos GA e potencializar o seu efeito na terapia do câncer de bexiga (CB). Assim, este projeto visa o desenvolvimento e caracterização de nanocarreador lipídico híbrido (NH), composto de carreador lipídico nanoestruturados revestidos com quitosana, como um sistema de liberação do extrato alcaloídico de S. Lycocarpum (EA), rico em GA, e avaliação antitumoral in vitro em cultura de 2D e 3D de células de câncer de bexiga. Os NH-EA foram preparados pelo método de emulsão e sonicação. NH-EA foram caracterizadas de acordo com diâmetro médio, distribuição de diâmetro, potencial zeta e influência do pH no potencial zeta por espalhamento de luz dinâmico (DLS) e a, distribuição e concentração de nanopartículas por analise de rastreamento de nanopartículas (NTA), porcentagem de eficiência de encapsulamento (EE%) por LC-MS/MS, morfologia por microscopia de força atômica (AFM) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM), índice de recristalização por Calorimetria diferencial de varredura (DSC), avaliação da propriedade mucoadesivas por DLS. A citotoxidade do EA livre e encapsulado em NH foi avaliada pelo ensaio de resazurina (modelo 2D) e baseados em ATP (modelo 3D). Para ensaio em 2D foram utilizadas as linhagens de câncer de bexiga (T24 e RT4) com tratamentos de 24 h e 72h e fibroblastos de camundongos (3T3) com tratamento de 24h. Para o ensaio 3D foram utilizadas as células RT4 com tempo de tratamento de 24h. A internalização das nanopartículas foi avaliada por imagens de microscopia de confocal com varredura laser. Foi avaliado os níveis de expressão de proteínas pro e anti -apoptóticas por Western blot e PCR tempo real. Obteve-se NH-EA com tamanhos médios de 130,12 nm com índice de polidispersão de 0,224. Todas as nanopartículas apresentaram potencial zeta positivo indicando o seu revestimento pela quitosana. Este potencial é alterado com aumento do pH do meio. Por NTA foi confirmado a baixa polidispersão das NH-EA com concentração de partículas de 2,50 x 1012 partículas/mL. A EE% foi alta com 91,08% para SS e 88,35% para SM. NH-EA apresentou formato esférico com índice de recristalização de 36,58% indicando acomodação do EA nos espaços do núcleo lipídico. NH-EA demonstrou interação física com a mucina. As nanopartículas foram estáveis por 60 dias. O NH vazio não foi citotóxico. Já o EA no modelo 2D foi citotóxico tanto livre (IC50 de 5,08 µg/mL para T24 e 9,19 µg/mL para RT4) como encapsulado em NH (IC50 de 6,06 µg/mL para T24 e 8,5 µg/mL para RT4) após 24 h e 72h de tratamento. Por não ser sítio-específico o NH-EA apresentou baixa seletividade quando comparado com células 3T3. NH-EA, no modelo 3D, apresentou IC50 duas vezes menor do que o EA livre representando o potencial de internalização do nanocarreador híbrido nos esferoides. O NH-EA demonstrou atividade citotóxica com indução da apoptose pela via intrínseca e extrínseca nas células RT4. Desta forma, os resultados deste trabalho indicam que o NH desenvolvido foi adequado para encapsular o EA com alta eficiência de encapsulamento e estabilidade, com propriedade mucoadesiva que é relevante para a administração intravesical, além de proporcionar o aumento do efeito citotóxico frente as células de câncer de bexiga em modelos 2D e 3D.
Title in English
Development, characterization and evaluation of the antitumor activity of a hybrid nanocarrier with alkaloidic extract from Solanum lycocarpum
Keywords in English
Alkaloidic extract
Bladder cancer
Chitosan
Cytotoxicity
Hybrid nanoparticles
Solanum lycocarpum
Abstract in English
Solanum lycocarpum is a species from the Brazilian cerrado known for its diversity in glycoalkaloids (GA).The GA, solasonine (SS) and solamargine (SM), extracted from the fruits of this plant, have antitumor properties. However, the low water solubility of these molecules and their toxicity limits the application of these GAs. The development of a nanostructured formulation containing GA may improve the antitumor action of GA. Thus, this research aims at the development and characterization of chitosan coated nanostructured lipid carriers (NH) as a hybrid delivery system of the alkaloidic extract of S. Lycocarpum (AE), and in vitro antitumor evaluation of this system in bladder cancer. NH-EA were prepared by the emulsion and sonication method. NH-AE were characterized according to diameter, diameter distribution, zeta potential and influence of pH on zeta potential by dynamic light scattering (DLS) and concentration of nanoparticles by nanoparticle tracking analysis (NTA), encapsulation efficiency (EE%) by LC-MS/MS, morphology by atomic force microscopy (AFM) and transmission electron microscopy (TEM), recrystallization index by Differential Scanning Calorimetry (DSC), evaluation of mucoadhesive property by DLS. The cytotoxicity of free and encapsulated AE in NH was evaluated by the resazurin assay (2D model) and ATP-based (3D model). For the 2D assay, bladder cancer strains (T24 and RT4) with 24 h and 72 h treatments and mouse fibroblasts (3T3) with 24 h treatments were used. For the 3D assay, RT4 cells with a treatment time of 24h were used. The internalization of the nanoparticles was evaluated by laser scanning confocal microscopy images. Expression levels of pro and anti-apoptotic proteins were evaluated by Western blot and real-time PCR. NH-AE was obtained with average sizes of 130.12 nm with a polydispersity index of 0.224. All nanoparticles showed positive zeta potential indicating their coating by chitosan. This potential changes with increasing pH of the medium. The low polydispersity of NH-AE was confirmed by NTA with a particle concentration of 2.50 x 1012 particles/mL. The EE% was high with 91.08% for SS and 88.35% for SM. NH-AE showed a spherical shape with a recrystallization index of 36.58%, indicating accommodation of the AE in the spaces of the lipid core. NH-AE demonstrated physical interaction with mucin. The nanoparticles were stable for 60 days. NH was not cytotoxic. The AE in the 2D model was cytotoxic both free (IC50 of 5.08 µg/mL for T24 and 9.19 µg/mL for RT4) and encapsulated in NH (IC50 of 6.06 µg/mL for T24 and 8.5 µg/mL for RT4) after 24 h and 72 h of treatment. As it is not site-specific, NH-EA showed low selectivity when compared to 3T3 cells. NH-EA, in the 3D model, presented IC50 twice lower than the free EA, representing the potential for internalization of the hybrid nanocarrier in the spheroids. NH-EA demonstrated cytotoxic activity with induction of apoptosis by the intrinsic and extrinsic pathway in RT4 cells. It is concluded that the development of NH was suitable for AE encapsulation, promoting high encapsulation efficiency and stability with cytotoxic effect against bladder cancer cells.
 
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Release Date
2024-06-10
Publishing Date
2022-08-26
 
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