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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2022.tde-18052022-084302
Documento
Autor
Nombre completo
Juliana Santos Rosa Viegas
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2022
Director
Tribunal
Bentley, Maria Vitoria Lopes Badra (Presidente)
Carrilho, Emanuel
Mosqueira, Vanessa Carla Furtado
Nascimento, Laura de Oliveira
Título en portugués
Desenvolvimento de carreador lipídico nanoestruturado contendo pool de siRNAs associados a agente antitumoral como uma abordagem terapêutica multifuncional para o câncer de pele
Palabras clave en portugués
5-fluorouracil
Câncer de pele
Carreador lipídico nanoestruturado
siRNA Bcl-2
siRNA EGFR
siRNA Gli-1
Terapia gênica
Resumen en portugués
O câncer de pele avança a cada ano no que diz respeito ao número de casos em todo o mundo, principalmente em países onde há predominância de caucasianos. Os tratamentos disponíveis estão cada vez menos efetivos devido às inúmeras mutações e para superar tais desafios, as terapias de silenciamento gênico têm sido amplamente adotadas. No presente trabalho desenvolveu-se um carreador lipídico nanoestruturado (CLN) contendo 5-Fluororuracil e pool de siRNAs, (siRNA Gli-1, siRNA EGFR e siRNA Bcl-2) de modo a atuar em diferentes vias do câncer de pele. O CLN foi desenvolvido em homogeneizador de alta pressão e otimizado por planejamento experimental. Foi caracterizado e apresentou-se com diâmetro de partícula entre 200 e 250 nm, índice de polispersão menor que 0,3, potencial zeta de 49 mV, número de nanopartículas 1012/ mL. Foram realizados estudos iniciais de escalonamento de 20 mL até 200 mL, apresentando-se em todos os volumes as mesmas caractetísticas físico-quimicas. A complexação com os siRNAs ocorreu nas razões N/P 2 para os siRNAs controle e Bcl-2, e N/P 5 para siRNA Gli-1 e EGFR, e todos descomplexaram eficientemente com competição aniônica utilizando heparina. A liberação de 5-FU deu-se pela cinética de Higuchi, liberando cerca de 60 a 80% de 5-FU em 8 horas de forma sustentada. Estudos cutâneos in vitro e ex vivo indicaram que o 5-FU retem-se majoritariamente da epiderme. Além disso não causa danos teciduais e reduz a descamação do estrato córneo. Estudos celulares (2D e esferoides 3D) indicaram que o sistema em si é pouco tóxico, porém quando associado aos agentes ativos reduz significantemente a viabilidade celular. A linhagem celular A431 e A375 foram as linhagens mais suscetíveis à combinação CLN 5-FU + siRNA Bcl-2, as linhagens Sk-mel-103 e 1205Lu, tiveram sua viabilidade reduzida frente a combinação CLN 5-FU + pool, evidenciando serem mais agressivas e resistentes. O uptake celular ocorreu eficientemente nas linhagens e a via de internalização determinada foi endocitose dependente por clatrina e uma parte minoritária por caveolina. Determinou-se in vitro, que o CLN multifuncional contendo 5-FU + pool siRNA foi eficiente em conter a migração das linhagens bem como em conter a invasividade da linhagem 1205Lu. A combinação CLN 5-FU + siRNA Bcl-2, avaliada in vivo em modelo xenotransplante da linhagem A431, mostrou-capaz de suprimir o crescimento tumoral com infiltração inflamatória controlada (baixos índices de mieloperoxidase, N-acetilglucosaminidase e TNF-α). Além disso, sinalizando apoptose tumoral eficaz, knockdown de Bcl-2 e negatividade para remodelação da matriz extracelular.
Título en inglés
Development of a nanostructured lipid carrier containing a pool of siRNAs associated with an antitumor agent as a multifunctional therapeutic approach for skin cancer
Palabras clave en inglés
5-fluorouracil
Bcl-2 siRNA
EGFR siRNA
Gene therapy
Gli-1 siRNA
Nanostructured lipid carrier
Skin cancer
Resumen en inglés
Skin cancer advances in number of cases worldwide, especially in countries where there is a predominance of Caucasians. The available treatments are less effective due to the mutations and to overcome these challenges, gene silencing therapies have been widely adopted. In the present work, a nanostructured lipid carrier (NLC) containing 5-Fluororuracil and a pool of siRNAs (siRNA Gli-1, siRNA EGFR and siRNA Bcl-2) was developed in order to act on different skin cancer pathways. The NLC was developed in high pressure homogenizer and optimized by experimental design. NLC was characterized and presented diameter between 200 - 250 nm, polydispersion index less than 0.3, zeta potential of 49 mV, and number of nanoparticles 1012/mL. Scaling up studies from 20 mL to 200 mL were performed, presenting the same physicochemical characteristics in all volumes. Complexation with the siRNAs occurred at N/P 2 ratio for control and Bcl-2 siRNAs, and N/P 5 ratio for siRNA Gli-1 and EGFR, and all decomplexed efficiently with anionic competition using heparin. The release of 5-FU occurred by Higuchi kinetics, releasing about 60 to 80% of 5-FU in 8 hours in a sustained manner. In vitro and ex vivo cutaneous studies indicated that 5-FU is mostly retained in the epidermis. In addition, it does not cause tissue damage and reduces the desquamation of the stratum corneum. Cellular studies (2D and 3D spheroids) indicated that the system itself is not toxic, but when associated with active agents it significantly reduces cell viability. The cells A431 and A375 were the most susceptible lines to the combination NLC 5-FU + Bcl-2 siRNA, the cells Sk-mel-103 and 1205Lu had their viability reduced for NLC 5-FU + pool, showing that they are more aggressive and resistant. Cell uptake occurred efficiently in the cells and the internalization pathway determined was endocytosis dependent by clathrin and a minority by caveolin. It was determined in vitro that the multifunctional NLC containing 5-FU + pool siRNA decreased the migration as well as decrease the 1205Lu invasiveness. The NLC 5-FU + siRNA Bcl-2, evaluated in vivo in a xenotransplant model of the A431, can suppress tumor growth with controlled inflammatory infiltration (low levels of myeloperoxidase, N-acetylglucosaminidase and TNF-α). Furthermore, NLC 5-FU + siRNA Bcl-2 presented effective tumor apoptosis, Bcl-2 knockdown and negativity for extracellular matrix remodeling.
 
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Fecha de Liberación
2024-03-24
Fecha de Publicación
2022-05-18
 
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