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Tesis Doctoral
DOI
10.11606/T.60.2017.tde-03022017-145030
Documento
Autor
Nombre completo
Sônia Aparecida Figueiredo
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2016
Director
Tribunal
Fonseca, Maria Jose Vieira (Presidente)
Antunes, Lusania Maria Greggi
Maruno, Monica
Vilela, Fernanda Maria Pinto
Rocha Filho, Pedro Alves da
Título en portugués
Desenvolvimento e validação de ensaios in Desenvolvimento e validação de ensaios in vitro usando culturas de células imortalizadas e primárias para avaliação da eficácia fotoprotetora de protetores solares empregando como parâmetros de medida as alterações induzidas na pele pelas radiações UVA e UVB
Palabras clave en portugués
Eficácia
Métodos in vitro
Protetores solares
Radiação Ultravioleta
Técnicas de Cultura de células
Resumen en portugués
A eficácia de protetores solares é determinada por métodos in vivo, que utilizam humanos, tais como: Fator de Proteção Solar (FPS), Immediate Pigment Darkening (IPD), Persistent Pigment Darkening (PPD) e Fator de Proteção UVA (FP-UVA). No entanto, esses parâmetros não refletem os efeitos danosos reais induzidos pela radiação solar sobre as estruturas e componentes celulares, como o DNA, lipídeos e proteínas. O objetivo deste estudo foi desenvolver ensaios in vitro com culturas de células para avaliar o potencial fotoprotetor de protetores solares empregando parâmetros biológicos que são alterados pela radiação UV. A primeira etapa deste estudo consistiu em selecionar a linhagem de células da pele (L929 ou HaCaT) que fornecesse a melhor relação entre dose de UVA ou UVB e o efeito danoso induzido. Este efeito foi quantificado pela medida da viabilidade celular, peroxidação lipídica e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). O melhor modelo de cultura celular foi tratado com protetores solares de duas marcas diferentes com FPSs de 15 a 60, obtidos no mercado local. Amostras dos fotoprotetores foram aplicadas em uma placa de quartzo colocada no topo de uma microplaca preenchida por células. A viabilidade celular e a peroxidação lipídica, medidas em fibroblastos L929, foram os parâmetros mais promissores para avaliar a eficácia de protetores solares expostos à UVB e permitiram discriminar o potencial fotoprotetor de formulações com diferentes FPSs. Por outro lado, a formação de EROs, expressa em queratinócitos HaCaT, provou ser um parametro biológico promissor para discriminar a eficácia de protetores solares com diferentes FPSs ou FPSs/PPDs, expostos à UVA. Atualmente, as empresas estão adicionando aos protetores solares filtros orgânicos que absorvem na região do UVA, principalmente na faixa do UVA-1. Alguns pesquisadores têm demonstrado que o proteoma é o alvo para as EROs induzidas por UVA. Essas EROs diminuem a atividade da calcineurina (Cn), enzima conhecida pelo seu papel no recrutamento de células T. A liberação do ânion fosfato do substrato, pela ação da enzima, reduz com o aumento da exposição da Cn à radiação UVA-1. Desta forma, um método foi desenvolvido com células primárias HDFn para a avaliação da eficácia fotoprotetora de protetores solares na faixa de UVA-1, empregando a medida da atividade da Cn. Os resultados mostraram que a redução da atividade da Cn só foi proporcional a dose de UVA-1 quando o homogeneizado de células HDFn, contendo 417,55 ± 8,79 ?g/mL de proteínas, foi exposto a diferentes doses de UVA-1. Quando as culturas de células foram irradiadas por diferentes doses de UVA-1, não foi observado diminuição da atividade da enzima. Em adição, para maior precisão na medida da atividade enzimática, os homogeneizados, expostos ou não à luz UVA-1 e protegidos ou não por diferentes protetores solares, tiveram que ser diluídos na proporção de 1:2 em tampão ensaio 2x (1:1, v/v), antes da quantificação do fosfato por verde de malaquita. A medida da atividade da Cn mostrou ser um ensaio eficiente para diferenciar fotoprotetores adicionados de filtros orgânicos específicos para faixa de UVA-1 (marca B) daqueles não adicionados desses filtros (marca A). Como também, o ensaio foi capaz de diferenciar os protetores solares da marca B, com diferentes valores de PPD: fotoprotetor com PPD-15 não foi capaz de evitar a redução da atividade enzimática, semelhante ao homogeneizado exposto à luz UVA-1 sem proteção, mas diferenciou dos demais PPDs; PPDs 25 e 41 protegeram a atividade da Cn em 34,53 ± 4,15% e 38,19 ± 5,50%, respectivamente. Assim, os parâmetros biológicos testados neste estudo podem atuar como alternativas complementares para avaliação da eficácia de fotoprotetores.
Título en inglés
Development and validation of in vitro assys using immortalized and primary cells culture for the evaluation of the photoprotective efficacy of sunscreens using as measurement parameters the changes induced in the skin by UVA and UVB radiation
Palabras clave en inglés
Cell culture techniques
Efficacy
in vitro methods
Sunscreens
Ultraviolet radiation.
Resumen en inglés
The effectiveness of sunscreens is usually determined by in vivo methods, which use humans, such as Sun Protection Factor (SPF), Immediate Pigment Darkening (IPD), Persistent Pigment Darkening (PPD) and UVA Protection Factor (UVA-PF). However, these parameters do not reflect the real damaging effects induced by solar radiation on the structures and cellular components as the DNA, lipids and proteins. The aim of this study was to develop in vitro methods with cell culture to assess the photoprotective potential of sunscreens using biological parameters that are changed by UV radiation. The first stage of this study to select the skin cells strain (L929 or HaCaT) that would provide the best relationship between dose of UVA or UVB radiation and induced deleterious effect. This effect was quantified by measuring cell viability, lipid peroxidation and generation of reactive oxygen species (ROS). The best cell culture model was treated with commercial sunscreens two brands with SPF 15- 60, obtained from a local market. Sunscreens samples were applied in a quartz plate placed on top of a microplate filled with cells. The cell viability and lipid peroxidation measured in L929 fibroblasts were the most promising for evaluating the efficacy of sunscreens exposed to UVB radiation and allowed to discriminate the photoprotective potential of formulations with different SPFs. On the other hand, ROS generation expressed in keratinocyte of the HaCaT proved to be a promising biological test for discriminating the effectiveness of sunscreens with different SPFs or SPFs/PPDs exposed to UVA radiation. Currently, companies are adding organic filters in sunscreens that absorb in the UVA region, especially in the UVA-1 range. Some researchers have shown that proteomics is the target for ROS induced by UVA. These ROS decrease the activity of calcineurin (Cn), an enzyme known for its role in T cell recruitment. The release of phosphate anion from substrate by enzyme action, it reduces with increasing exposure of Cn to UVA-1 radiation. Thus, a method was developed with HDFn primary cells for evaluation of photoprotective efficacy of sunscreens in the UVA-1 range, using the measure of Cn activity. The results showed that the reduction of Cn activity was only proportional to the dose of UVA-1 when the HDFn cell homogenate, containing 417.55 ± 8.79 mg/mL protein, was exposed to different doses of UVA-1. When cell cultures were irradiated with different doses of UVA-1, there was no reduction in enzyme activity. In addition, for greater precision in the measurement of enzymatic activity, the homogenates, exposed or not to UVA-1 radiation and protected or not with different sunscreens, they had to be diluted at a ratio of 1:2 in buffer before of phosphate quantification for malachite green. The measure of Cn activity proved to be an efficient test to differentiate photoprotectors added specific organic filters for UVA range (brand B) of those not added these filters (brand A). As well, the assay was able to differentiate the sunscreens of brand B, but with different values of PPD: photoprotector with PPD-15 was not able to prevent the reduction of enzyme activity, similar to the homogenate exposed to UVA light without protection, but differentiated from other PPDs; PPDs 25 and 41 protected the activity of Cn to 34.53 ± 4.15% and 38.19 ± 5.50%, respectively. Thus, the biological parameters tested in this study can serve as additional alternatives for assessing the effectiveness of sunscreens.
 
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Fecha de Liberación
2019-02-03
Fecha de Publicación
2017-04-27
 
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