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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2020.tde-28032020-215307
Document
Author
Full name
Iara Aimê Cardoso
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2019
Supervisor
Committee
Nonato, Maria Cristina (President)
Ambrosio, Andre Luis Berteli
Anibal, Fernanda de Freitas
Salinas, Roberto Kopke
Title in English
Structural and biochemical characterization of Schistosoma mansoni class II fumarate hydratase enzyme
Keywords in English
Fumarate hydratase
Kinetic characterization
Schistosoma mansoni
X-ray crystallography
Abstract in English
Schistomiasis is a neglected tropical disease caused by trematodes worms from the genus Schistosoma. Schistosomiasis is the second most devastating parasitic disease after malaria. The disease has a high economic burden and affects mainly poor population without access to proper sanitation. Praziquantel is the only drug approved for the treatment of schistosomiasis and resistance is already reported. Fumarate hydratases or fumarases are enzymes that catalyze the reversible hydration of fumarate to L-malate. This enzyme participates in DNA repair and important metabolic processes such as the urea and the tricarboxylic acid cycles. Fumarases are divided in two classes, and Schistosoma mansoni possess both, being class I localized in mitochondria, while class II is cytosolic. The fundamental role of fumarases in the metabolism make them potential target for drug design against schistosomiasis. This work describes, for the first time, the cloning, expression and purification protocol for the class II fumarate hydratase from Schistosoma mansoni (SmFHII). In order to estimate the contribution of the reverse reaction, the enzyme was kinetically characterized using both substrates concomitantly. SmFHII was shown to follow a MichaelisMenten mechanism of catalysis with of 19 mM-1s-1 and of 49 mM-1s-1, and of 0.56 mM and of 0.15 mM. Differential scanning fluorimetry (DSF) performed under different chemical environments shows that the highest thermal stability is reached at pH 7.5 and at higher ionic strength. The significant thermoshift observed for SmFHII in presence of well known ligands makes DSF the adequate technique for ligand screening. SmFHII structure in complex with L-malate was determined by single crystal X-ray diffraction, at 1.85 Å resolution. A new construct [SmFHII(Δ263-277)] lacking the additional portion only found in trematode worms was also evaluated by kinetic and DSF experiments. Although not essential for activity, the results suggest that the removal of this region impacts on protein stability and may has influence on L-malate catalysis. The differences between SmFHII and human fumarase are distributed all over the structure, and could be explored to design new selective inhibitors.
Title in Portuguese
Caracterização estrutural e bioquímica da enzima fumarato hidratase classe II de Schistosoma mansoni
Keywords in Portuguese
Caracterização cinética
Cristalografia de raios-x
Fumarato hidratase
Schistosoma mansoni
Abstract in Portuguese
A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada causada por parasitas trematódeos do gênero Schistosoma. A esquistossomose é a segunda doença parasitária mais devastadora do mundo, atrás apenas da malária. A doença tem um alto impacto econômico, afetando principalmente a população pobre sem acesso a saneamento adequado. Praziquantel é o único medicamento aprovado para o tratamento da esquistossomose e já existem relatos de parasitas resistentes a esse fármaco. Fumarato hidratases ou fumarases são enzimas que catalisam a hidratação reversível de fumarato em L-malato. Essa enzima participa do reparo ao dano do DNA e de processos metabólicos importantes, como os ciclos da uréia e do ácido tricarboxílico. As fumarases são divididas em duas classes e o S. mansoni possui ambas, sendo a classe I mitocondrial, enquanto a classe II é citosólica. O papel fundamental da fumarase no metabolismo faz dela um alvo potencial para o planejamento de fármacos contra a esquistossomose. Este trabalho descreve, pela primeira vez, o protocolo de clonagem, expressão e purificação da fumarato hidratase classe II de Schistosoma mansoni (SmFHII). De forma a estimar a contribuição da reação reversa, a enzima foi caracterizada cineticamente utilizando os dois substratos concomitantemente. A SmFHII demonstrou seguir o mecanismo de catálise de Michaelis-Menten, tendo um de 19 mM-1s-1 e de 49 mM-1s-1, e de 0,56 mM e de 0,15 mM. Fluorimetria de varredura diferencial (DSF) realizada em diferentes ambientes químicos demonstrou que a maior estabilidade térmica da proteína é alcançada em pH 7,5 e também com o aumento alta força iônica, além de ser uma técnica útil para a triagem de ligantes. A estrutura da SmFHII foi determinada por difração de raios-X de monocristal, com uma resolução de 1,85 Å. Uma nova construção [SmFHII(Δ263-277)] sem a porção adicional, encontrada apenas em vermes de trematódeos, também foi avaliada por ensaios cinéticos e de DSF. Embora não seja essencial para a atividade enzimática, os resultados sugerem que a remoção dessa região afeta a estabilidade da proteína e pode ter influência na catálise do L-malato. As diferenças entre SmFHII e fumarase humana estão distribuídas por toda a estrutura e podem ser exploradas para delinear novos inibidores seletivos.
 
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Release Date
2022-03-28
Publishing Date
2020-05-12
 
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