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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2020.tde-18122019-172933
Document
Author
Full name
Laísa Bonafim Negri
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2019
Supervisor
Committee
Silva, Roberto Santana da (President)
Naal, Rose Mary Zumstein Georgetto
Ribeiro, Anderson Orzari
Baptista, Mauricio da Silva
Title in Portuguese
Fotobiomodulação e óxido nítrico como estratégias para potencializar a ação antitumoral da terapia fotodinâmica mediada por rutênio-ftalocianinas: Aspectos químicos, bioquímicos e fotobiológicos
Keywords in Portuguese
Fotobiomodulação
Óxido nítrico
Rutênio-Ftalocianina
Terapia fotodinâmica
Abstract in Portuguese
A irradiação luminosa tem sido utilizada por várias décadas em terapia clínica, entre elas destaca-se a Terapia Fotodinâmica (TFD). A TFD favorece a morte celular através da combinação do efeito de um fotossensibilizador, da luz e do oxigênio para gerar espécies reativas de oxigênio (ERO). No entanto, quando um desses componentes é um fator limitante, as células tratadas, ao invés de morrerem, podem ativar vias bioquímicas de defesa que promovem o crescimento celular, propiciando a recorrência tumoral. Baseado nisso, a proposta deste trabalho é apresentar estratégias que possam potencializar a morte de células tumorais pela TFD, evitando a sobrevivência de fragmentos celulares e possível recidiva da doença. Uma das possibilidades é o desenvolvimento de fotossensibilizadores que além de produzir ERO, possam também produzir óxido nítrico (NO), uma molécula que além de um radical que propicia o stress oxidativo e nitrosativo celular, é um importante mensageiro biológico que apresenta um duplo papel na regulação de vias bioquímicas que controlam a recuperação celular. Dessa forma, este trabalho consiste no aprimoramento da síntese dos fotossensibilizadores do tipo rutênio-ftalocianina, trans-[RuCl(Pc)(DMSO)] e trans- [Ru(NO)(Pc)(NO2)]. A caracterização foi realizada por diferentes técnicas analíticas como UV-Vis, Infravermelho, RMN, EPR e espectrometria de massas que, em conjunto, permitiram avaliar a eficiência das rotas sintéticas utilizadas. Os aspectos fotoquímicos e fotofísicos foram avaliados em relação à produção de ERO e NO por irradiação luminosa em 660 nm e processos redutimétricos. A citotoxicidade dos complexos foi avaliada na ausência e presença de irradiação em 660 nm, tanto nas linhagens tumorais B16F10, A375 e MCF7 quanto nas linhagens não-tumorais 3T3, L929 e MCF10. O efeito sinergístico do NO e ERO produzidos pela fotoestimulação do complexo trans-[Ru(NO)(Pc)(NO2)] foi avaliado e comparado com o efeito na citotoxicidade do complexo trans-[RuCl(Pc)(DMSO)], que quando fotoestimulado produz apenas ERO. Os estudos de viabilidade celular mostraram que 1,0 µM dos complexos trans-[RuCl(Pc)(DMSO)] e trans-[Ru(NO)(Pc)(NO2)], sob TFD 3,0 J.cm-2, promoveram morte celular de 63% e 90% para A375 e 64% e 72% para MCF7, respectivamente. Os estudos se estenderam quanto à relevância da sublocalização celular dos complexos através da microscopia confocal, com diferentes marcadores biológicos, e o que esse resultado implica no processo de morte celular. O mecanismo de morte celular foi estudado por Western Blotting, constatando-se que há a expressão das proteínas caspase-3-clivada, BAX e citococromo c, quando as células tumorais são submetidas à TFD mediante os complexos, sugerindo o estímulo do processo apoptótico pela via intrínseca. O efeito sinergístico do NO na TFD foi estudado avaliando-se o papel do NO na recorrência celular pelos ensaios de Scratch Wound e na regulação dos mecanismos de sobrevivência relacionados à expressão do fator de transcrição anti-apoptótico NF-kB. O NO pareceu inibir o NF-kB, sugerindo que o efeito sinergístico se deu tanto pelo estímulo de proteínas pró-apoptóticas quanto pela inibição de proteínas anti-apoptóticas. Outra estratégia apresentada a fim de potencializar a TFD, é a fotoestimulação em duplo comprimento de onda, fazendo a aplicação de uma nova terapia chamada Fotobiomodulação (PBM) em 850 nm, seguida da TFD em 660 nm. No presente trabalho, discute-se como a PBM pode modular a via de sinalização, via produção de ROS, ATP e NO, e influenciar na internalização celular dos complexos favorecendo o efeito sinergístico na morte celular quando combinado à TFD.
Title in English
Photobiomodulation and nitric oxide as strategies to potentiate the antitumor action of photodynamic therapy mediated by ruthenium-phthalocyanines: Chemical, biochemical and photobiological aspects
Keywords in English
Nitric oxide
Photobiomodulation
Photodynamic therapy
Ruthenium-phthalocyanine
Abstract in English
Light irradiation has been used in clinical therapy, including Photodynamic Therapy (PDT), for several decades. PDT favors cell death by combining the effect of a photosensitizer, light, and oxygen to generate reactive oxygen species (ROS). However, when one of these components is a limiting factor, instead of dying, the treated cells can activate biochemical defense pathways that promote cell growth, causing the tumor to recur. This work aims to present strategies that can potentiate the tumor cell death elicited by PDT, avoiding cellular fragment survival and possible disease recurrence. One of the possibilities is to develop photosensitizers that can produce not only ROS, but also nitric oxide (NO), a radical molecule that underlies oxidative and nitrosative cellular stress and which is an important biological messenger that plays a dual role in regulating biochemical pathways controlling cell recovery. This work has improved the synthesis the ruthenium-phthalocyanine photosensitizers trans- [RuCl(Pc)(DMSO)] and trans-[Ru(NO)(Pc)(NO2)], which were characterized by different analytical techniques such as UV-Vis, Infrared, NMR, EPR, and mass spectrometry. Together, these techniques helped to evaluate the efficiency of the employed synthetic routes. Photochemical and photophysical aspects were examined in terms of ERO and NO production by light irradiation at 660 nm and reductimetric processes. The cytotoxicity of the photosensitizers was assessed in both the absence and presence of irradiation at 660 nm against the tumor lines B16F10, A375, and MCF7 and the non-tumor cell lines 3T3, L929, and MCF10. The synergistic effect between NO and ERO elicited by trans- [Ru(NO)(Pc)(NO2)] photostimulation was evaluated and compared to the cytotoxic effect of trans-[RuCl(Pc)(DMSO)]--when photostimulated, the latter complex produces only ROS. The cell viability studies showed that 1.0 µM trans- [RuCl(Pc)(DMSO)] and trans- [Ru(NO)(Pc)(NO2)] complexes under 3.0 J.cm-2 PDT promoted 63% and 90% A375 cell death and 64% and 72% MCF7 cell death, respectively. The studies were extended regarding the relevance of the photosensitizer cellular sub-localization as assessed by confocal microscopy with different biological probes. The results implied cell death. The cell death mechanism was investigated by Western blot, which revealed expression of caspase-3-cleaved proteins, BAX, and cytochrome c when the tumor cells were submitted to PDT in the presence of the synthesized photosensitizers. This suggested that apoptosis was stimulated by the intrinsic pathway. The NO synergistic effect NO on PDT was studied by evaluating the role that NO plays in cell recurrence by the Scratch Wound assays and the regulation of survival mechanisms related to the expression of the anti-apoptotic transcription factor NFkB. NO appeared to inhibit NF-kB, suggesting that the synergistic effect was due to proapoptotic protein stimulation and anti-apoptotic protein inhibition. Another strategy that seemed to potentiate PDT was double wavelength photostimulation by using a new therapy called Photobiomodulation (PBM) at 850 nm, followed by PDT at 660 nm. The way PBM can modulate the signaling pathway via ROS, ATP, and NO production and how the photosensitizer cellular internalization combined with PDT favors the synergistic effect on cell death are also discussed.
 
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Release Date
2021-12-17
Publishing Date
2020-05-12
 
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