Segundo dados recentes da Organização Mundial de Saúde, as doenças parasitárias afetam um sexto da população mundial, totalizando de mais de um bilhão de pessoas. A esquistossomose, em particular, é uma doença parasitária negligenciada pela saúde pública, causada pelo parasita helminto trematódeo do gênero Schistosoma, e que afeta mais de 230 milhões de indivíduos em todo o mundo, 6 milhões no Brasil, causando risco a aproximadamente 700 milhões de pessoas. Na busca por novas ferramentas para o combate à esquistossomose, uma importante estratégia consiste na identificação e caracterização de alvos moleculares do parasita Schistosoma. As fumarato hidratases são enzimas que catalisam a hidratação reversível da molécula de fumarato em S-malato e têm sido consideradas potenciais alvos macromoleculares para o planejamento de novos fármacos antiparasitários. Dentro desse contexto, o presente trabalho visou a clonagem, expressão, purificação e caracterização estrutural e bioquímica do produto do gene Smp_158240, predito como codificador da enzima fumarato hidratase para o parasita Schistosoma mansoni. O gene Smp_158240 foi sintetizado quimicamente com otimização de códons para expressão em E. coli e clonado nos vetores de expressão pET28a e pET28sumo. O produto do gene, denominado SmFH foi expresso em bactéria E. coli BL21(DE3) e purificado com excelente rendimento e grau de pureza. Estudos de espalhamento dinâmico de luz, associados à cromatografia por filtração em gel indicam que a proteína SmFH se oligomeriza na forma de um tetrâmero, e estudos por dicroísmo circular foram utilizados para estimar o conteúdo de estrutura secundária em 60,8 % de α-hélices, 5,7 % de fita-β e 37,6 % de coil-turn. Apesar dos resultados indicarem que a SmFH se oligomeriza e se enovela como previamente reportado para as enzimas fumarato hidratase da classe II, os ensaios de atividade indicaram que o produto do gene Smp_158240 apresenta baixa atividade fumarásica e se mostra instável para a realização dos experimentos de cristalização. A realização de predição de estrutura por modelagem molecular por homologia identificou regiões de grandes diferenças entre o modelo gerado para SmFH e as estruturas descritas para outras enzimas da mesma classe. Em particular, uma dessas variações consiste na inserção de 7 resíduos em uma região altamente conservada do sítio ativo (SS-loop), alterando significativamente a conformação e dinâmica da proteína e fornecendo assim as bases estruturais para justificar a falta de atividade observada para o produto codificado pelo gene Smp_158240. Uma análise estrutural cuidadosa do modelo predito para SmFH, associado à análise do padrão da estrutura primária encontrado para enzimas da mesma classe sugere um erro na sequência do gene depositada no banco de dados e permite propormos a correta sequência para o gene que codifica a enzima fumarato hidratase em Schistosoma mansoni.

According to recent data from World Health Organization, parasitic diseases affect one sixth of the world population, with a total of over a billion people. Schistosomiasis, in particular, is a parasitic disease neglected by public health system and pharmaceutical industries, caused by trematode helminth Schistosoma, which affects 230 million people worldwide, 6 million in Brazil, risking about 700 million people. In the search for new tools against schistosomiasis, an important strategy consists in the identification and characterization of potential molecular targets from Schistosoma. Fumarate hydratase are enzymes that catalyze the reversible hydration of fumarate to malate, and have been considered potential macromolecular targets for new antiparasitic drug design. Within this context, the present work report the cloning, expression, purification and structural and biochemical characterization of Smp_158240 gene product predict to code the enzyme fumarate hydratase for Schistosoma mansoni (SmFH). The gene Smp_158240 has been chemically synthesized with optmized codons for E. coli expression and cloned into pET28a e pET28sumo expression vectors. The gene product, named SmFH has been expressed in E. coli BL21(DE3) and purified with excellent yield and purity. Dynamic light scattering studies associated with molecular exclusion chromatography have indicated that protein oligomerizes in a tetramer and circular dichroism techniques have been used to estimate secondary structure content as 60.8% in α-helix, 5.7% β-ribbon and 37.6% in coil-turn. Although results indicate that SmFH oligomerization and folding state are consisted with previous data reported to fumarate hydratases from class II, activity assays indicates that Smp_158240 gene product presents low fumarasic activity as well as high instability for for crystallization experiments. The 3D structure prediction by molecular modeling based on homology has allowed us to identify large differences between the SmFH model and the structures reported for enzymes within the same class. In particular, one of these variations includes an insertion of 7 residues in a highly conserved region within the active site (SS loop), significantly altering the conformation and dynamics of the protein and providing the structural basis in order to justify the lack of activity observed for the product of the gene Smp_158240. A careful structural analysis for the predicted model, associated to the observation of primary structure pattern found for enzymes from the same class, suggest a mistake in the sequence reported in the data bank and allow us to predict the correct sequence that codes for the enzyme fumarato hydratase in Schistosoma mansoni.