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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.60.2012.tde-28062012-143733
Document
Auteur
Nom complet
Andrea Casella Martins
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2012
Directeur
Jury
Crott, Luciana Simon Pereira (Président)
Medeiros, Alexandra Ivo de
Santos, Wagner Ferreira dos
Titre en portugais
Investigação de efeitos imunomoduladores de veneno bruto de Tityus serrulatus sobre funções de linfócitos T humanos
Mots-clés en portugais
citocinas
imunofenotipagem
imunomodulação
linfócitos T
proliferação celular
Tityus serrulatus
venenos animais
Resumé en portugais
Escorpiões da família Buthidae estão envolvidos na maioria dos envenenamentos em todo o mundo. Tityus é um dos gêneros dessa família, sendo Tityus serrulatus a espécie mais perigosa, por estar envolvida em envenenamentos graves, nos quais as vítimas são crianças, podendo levar a óbito. As manifestações da picada incluem dor local, hipersensibilidade, hipertensão, manifestações cardiovasculares e edema pulmonar. A peçonha do T. serrulatus contem, entre outros componentes, várias toxinas que atuam em canais de K+, Na+ e Ca2+ e que são responsáveis pelos efeitos tóxicos do veneno. Estudos recentes mostraram que a peçonha de T. serrulatus pode ativar macrófagos que são críticos na resposta imune e desempenham papel fundamental na resposta humoral e celular. Entretanto, pouco se conhece sobre os efeitos diretos dessas peçonhas sobre linfócitos humanos. Considerando que a modulação de funções celulares como proliferação, ativação e produção de citocinas pode desempenhar papel importante em envenenamentos, o presente estudo propôs: a) avaliar o efeito citotóxico do veneno bruto de Tityus serrulatus (VTs) sobre células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC); b) analisar o efeito do VTs sobre a modulação da expressão de marcadores fenotípicos (CD3, CD4, CD8 e CD19) e de marcadores de ativação celular, incluindo CD69, CD25 e HLA-DR em células T e B; c) avaliar o efeito do VTs sobre a proliferação de linfócitos T; d) avaliar a capacidade do VTs em modular a produção de citocinas pelas PBMC. Ensaios de citotoxicidade foram realizados pela técnica do MTT (3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) e mostraram que as concentrações de 500, 1000 e 2000 ?g/mL do VTs apresentaram citotoxicidade baixa a moderada para PBMC (12,7, 22,2 e 23,7% de redução na viabilidade celular, respectivamente). Concentrações de 25, 50 e 100 ?g/mL não foram citotóxicas. Com base nesses ensaios, estas ultimas concentrações foram utilizadas nos ensaios subsequentes. A citometria de fluxo foi empregada para avaliação da proliferação celular, da expressão de marcadores fenotípicos e de ativação celular, bem como para a quantificação de citocinas nos sobrenadantes de culturas celulares. As concentrações utilizadas não induziram alterações significativas nas subpopulações de linfócitos e não modificaram a expressão de marcadores de ativação em linfócitos T CD4+, CD8+ e B, após 24h de cultivo. O ensaio de proliferação celular, utilizando marcação concomitante com diacetato carboxifluoresceína succinimidyl ester (CFSE) e anticorpos monoclonais contra marcadores fenotípicos e marcadores de ativação celular, permitiu que se avaliasse não só a proliferação, mas a discriminação das diferentes subpopulações celulares e o estado de ativação das mesmas após 96h de cultivo. Os resultados sugerem que o VTs inibe a proliferação de linfócitos estimulados com fitohemaglutinina (PHA), e em especial a porcentagem de linfócitos T CD8+CD25+ (linfócitos T citotóxicos ativados). O VTs não foi capaz de induzir proliferação celular. Em contraste, o VTs quando adicionado isoladamente à cultura de PBMC, nas concentrações de 50 e 100 ?g/mL, induziu a produção de IL-6 (p<0,05 e p<0,01, respectivamente), uma citocina pró-inflamatória que desempenha papeis importantes nas respostas imunes ii inata e adaptativa. A secreção aumentada de IL-6, portanto, não está vinculada a aumento na proliferação celular. A presença do VTs concomitantemente à PHA apresentou tendência para inibição da produção de citocinas por células estimuladas com a PHA, como IL-10, TNF e IFN-gama. Os resultados sugerem que o VTs é uma fonte potencial de substâncias com ações imunomoduladoras sobre linfócitos T humanos e estimulam novas investigações para o esclarecimento dos mecanismos de ação envolvidos, incluindo estudos que considerem a participação dos canais iônicos de linfócitos T nos fenômenos observados. Essas investigações, juntamente com a identificação dos componentes da peçonha, responsável pela atividades observadas, poderão contribuir para a descoberta de ferramentas para estudo dos mecanismos fisiopatológicos do envenenamento, bem como para a descoberta de novas alternativas de tratamento para doenças mediadas pelo sistema imune.
Titre en anglais
Investigation of the immunomodulatory effects of crude venom of Tityus serrulatus on human T lymphocytes functions
Mots-clés en anglais
animal venoms
cell proliferation
cytokines
immunomodulation
immunophenotyping
T lymphocytes
Tityus serrulatus
Resumé en anglais
Scorpions of the Buthidae family are involved in most envenomations worldwide. Tityus is one of the genera of this family, being Tityus serrulatus the most dangerous species, because it is involved in severe envenomation, in which the victims are children and it can lead to death. The manifestations of scorpion sting are classified from mild to severe and its clinical signs include local pain, hypersensitivity, hypertension, cardiovascular manifestations and pulmonary edema. T. serrulatus venom contains, among other components, various toxins that act on K+, Na+ and Ca2+ channels, and are responsible for the toxic effects of the venom Recent studies showed that the venom of T. serrulatus (VTs) can activate macrophages that are critical to immune response and play a key role in the humoral and cellular response. However, little is known about the direct effects of these venoms on human lymphocytes. Considering that the modulation of cellular functions such as proliferation and induction of citokines production may play an important role in envenomation, the study proposed: a) to evaluate the cytotoxic effects of crude venom on peripheral blood mononuclear cells, b) to examine the effect of VTs on the modulation of expression of phenotypic markers (CD3, CD4, CD8 and CD19) and markers of cellular activation, including CD69, CD25 and HLA-DR on T and B cells c) to evaluate the VTs effect on the proliferation of T lymphocytes d) to evaluate the ability of VTs to modulate cytokine production by PBMC. Cytotoxicity assays were performed by the technique of MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide) and showed that VTs concentrations of 500, 1000 and 2000 ?g/mL showed low to moderate cytotoxicity to PBMC (12.7, 22.2 and 23.7% reduction in cell viability, respectively). Concentrations of 25, 50 e 100 ?g/mL were not cytotoxic. Based on these tests, these concentrations were used in subsequent trials. Flow cytometry was used to assess cell proliferation, expression of phenotypic markers and cell activation, as well as for the quantification of cytokines in supernatants of cell cultures. The concentrations used did not induce significant changes in subpopulations of lymphocytes and did not modify the expression of activation markers on CD4+, CD8+ and B cells, after 24 hours of culture. The cellular proliferation assay, using simultaneously diacetate carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) and monoclonal antibodies against phenotypic markers and cell activation markers, allowed the evaluation not only of proliferation, but the discrimination of different cell subpopulations and activation state of the same after 96h of culture. The results suggest that VTs inhibits the proliferation of lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin (PHA), and in particular the percentage of T lymphocytes CD8+ CD25+ (activated cytotoxic T lymphocytes). The VTs were not able to induce cell proliferation. In contrast, the VTs when added alone to the culture of PBMC at concentrations of 50 and 100 ?g/mL induced production of IL-6 (p <0.05 and p <0.01, respectively), a proinflammatory cytokine that plays important roles in innate and adaptive immune responses. The increased secretion of IL-6, therefore, is not linked to increased cell proliferation. The presence of VTs concurrently with PHA tended to inhibit cytokine production by cells stimulated with PHA, as IL-10, TNF and iv IFN-gamma.The results suggest that the VTs is a potential source of substances with immunomodulatory actions on human T lymphocytes and stimulate further research to elucidate the mechanisms of action involved, including studies to consider the participation of ion channels of T lymphocytes in the phenomena observed. These investigations, along with the identification of the components of the venom responsible for the observed activities may contribute to the discovery of tools to study the pathophysiological mechanisms involved in the envenomation as well as for the discovery of new treatment alternatives for diseases mediated by the immune system.
 
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Andrea_corrigido.pdf (1.29 Mbytes)
Date de Publication
2013-05-06
 
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