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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2017.tde-23112017-111520
Document
Author
Full name
Fabian Camilo Niño Arias
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2017
Supervisor
Committee
Abrahão, Ana Amelia Carraro (President)
Almeida, Ana Marisa Fusco de
Sivieri, Katia
Saltoratto, Ana Lucia Fachin
Title in Portuguese
Estudos de virulência, adesão e invasão in vitro de Staphylococcus aureus isolado de queijo tipo Minas
Keywords in Portuguese
Adesão e invasão de células eucarióticas
Atividade antimicrobiana
Laticínios
Staphylococcus aureus
Virulência
Abstract in Portuguese
Staphylococcus aureus é um micro-organismo amplamente adaptável, assim, pode viver em uma grande variedade de ambientes, inclusive nos alimentos. Dentre as toxi-infecções alimentares de origem bacteriana relatadas, cerca de 50% estão relacionadas com a produção de enterotoxina estafilocócica. No Brasil, o queijo Minas frescal é o tipo de queijo mais consumido (aproximadamente 30g/pessoa/dia) e a ocorrência desta bactéria é alta em queijos artesanais. Para este estudo, foram obtidos isolados de S. aureus produtores de enterotoxina e foram selecionados também dez isolados bacterianos, como microbiota acompanhante de uma amostra de queijo Minas. Foi avaliada a atividade inibitória da microbiota acompanhante frente a S. aureus, por meio de testes de antagonismo em ágar. Dentre as bactérias testadas, um isolado de Leuconostoc mesenteroides MC5 e um isolado de Lactococcus lactis MC5 mostraram atividade antiestafilocócica. Foi realizado também teste em ágar, com utilização de proteases, para avaliação da natureza proteica do inibidor, que seria indicativa da presença de bacteriocinas. Esses compostos são de grande interesse para bioconservação de alimentos e, neste trabalho, foi verificada a natureza proteica do (s) inibidor (es) produzido (os) por L. lactis. A persistência de S. aureus no ambiente de produção de alimentos derivados de leite depende, em parte, de sua capacidade de adesão e invasão em células eucarióticas, causando mastite em gado leiteiro. Além disso, S. aureus é um importante patógeno nosocomial, com potencial para causar além de gastrenterite por produção de enterotoxinas, quadros de infecção em outros sítios anatômicos. Desse modo, foi avaliada também neste trabalho, a capacidade de adesão e invasão de um isolado selecionado de S. aureus isolado de queijo Minas, utilizando como modelo cultura de células eucarióticas das linhagens Hep-2 e Caco-2. Para este ensaio, culturas de células eucarióticas foram infectadas com S. aureus em combinação com L. lactis MC5 e/ou L. mesenteroides MC5, bem como foi avaliada a atividade antimicrobiana do extrato bruto da cultura de L. lactis MC5(sobrenadante livre de células - SLC). Os resultados dos testes de adesão-invasão foram altamente dependentes da cultura celular avaliada e das condições experimentais relativas ao metabolismo bacteriano e da célula hospedeira. Finalmente, foram selecionados genes importantes para a virulência de S. aureus (hla, icaA e sea) para estudos de expressão gênica por meio da técnica de PCR em tempo real, demonstrando diferenças significativas na expressão dos três genes quando testados em diferentes condições de cultivo, o que poderia sugerir que o potencial virulento de S. aureus está diretamente relacionado a condições ambientais e locais de isolamento, com implicações importantes para a garantia da inocuidade de alimentos.
Title in English
Virulence studies, in vitro adhesion and invasion of Staphylococcus aureus isolated from Minas cheese
Keywords in English
Cell culture
Dairy products
Inhibitory activity
Staphylococcus aureus
Virulence
Abstract in English
Staphylococcus aureus is a widely adaptable microorganism, it can live in a wide variety of environments including food. Among the bacterial foodborne reports, about 50% are related to the enterotoxins production. In Brazil, Minas frescal cheese is the most consumed cheese type (approximately 30g / person / day) and the occurrence of this bacterium is high in artisanal cheeses. For this study, isolates of S. aureus enterotoxin producer were obtained and ten bacterial isolates were selected such as microbiota from a Minas cheese sample. The inhibitory activity of the microbiota against S. aureus was evaluated by antagonism agar tests. Among the bacteria tested, one isolate of Leuconostoc mesenteroides and one isolate of Lactococcus lactis showed antiesthetikococcal activity. Agar test using proteases, was also carried out to evaluate the protein nature of the inhibitor, which would be indicative of bacteriocin production. These compounds have a great interest for food bioconservation; in this work was determined the protein nature of the inhibitor (s) produced by L. lactis. The persistence of S. aureus in the milk-derived food production environment depends, in part, on its capacity for adhesion and invasion in eukaryotic cells, causing mastitis in dairy cattle. In addition, S. aureus is an important nosocomial pathogen causing of gastroenteritis by enterotoxin production and infection in other anatomical sites. Thus, the capacity of adhesion and invasion of a selected isolate of S. aureus isolated from Minas cheese, using a Hep-2 and Caco-2 models of eukaryotics cells cultures was also evaluated. For this assay, eukaryotic cell cultures were infected with S. aureus in combination with L. lactis and/or L. mesenteroides, as well the antimicrobial activity of crude extract from L. lactis (cell free supernatant - SLC). The results of the adhesion-invasion tests were highly dependent on the assessed cell culture and experimental conditions concerning bacterial and host cell metabolism. Finally, important S. aureus virulence genes (hla, icaA and SEA) were selected for the study of gene expression through the real-time PCR technique demonstrating significant differences in the expression of the three genes when tested in the different media, which could suggest that the virulent potential of S. aureus is directly related to environmental and local conditions of isolation, with important implications for food safety assurance.
 
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Release Date
2019-11-23
Publishing Date
2021-04-09
 
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