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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2017.tde-23112017-101039
Documento
Autor
Nombre completo
Bruna Samhan Archangelo
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2017
Director
Tribunal
Russo, Elisa Maria de Sousa (Presidente)
Martinez, Edson Zangiacomi
Braga, Eliane Candiani Arantes
Cunha, Anderson Ferreira da
Título en portugués
Expressão do fator estimulador de colônia de granulócito humano recombinante (rhG-CSF) em sistema Pichia pastoris e otimização do bioprocesso
Palabras clave en portugués
Delineamento composto central
Delineamento experimental
G-CSF
Pichia pastoris
Plackett-Burman
Screening design
Resumen en portugués
O fator estimulador de colônias de granulócito humano (hG-CSF) atua principalmente promovendo a maturação dos neutrófilos. Tem sido utilizado no tratamento de diversas patologias, sobretudo em neutropenias provocadas por eventos que suprimem a produção de células mieloides. No Brasil, este medicamento está inserido no Programa de Assistência Farmacêutica do SUS como medicamento excepcional, porém a um altíssimo custo para aquisição, pois ainda não é produzido no Brasil. Um estudo de viabilidade técnico-econômica da implantação da produção de rhG-CSF no Brasil demonstrou que esse medicamento pode ser produzido por custos até cerca de 90% inferiores aos valores pagos em compras governamentais. Este trabalho mostra a clonagem e expressão do rhG-CSF em sistema heterólogo de P. pastori e visou estabelecer os melhores parâmetros para a indução e produção da mesma em diferente condições de cultivo, além de uma caracterização da linhagem produtora. A construção do plasmídeo de expressão foi feita com o vetor pPICZαA e confirmada por sequenciamento nucleotídico. Após a transformação em P. pastoris, algumas colônias foram testadas para avaliar as condições da expressão da proteína recombinante. A colônia que apresentou uma expressão melhor foi escolhida a produção da proteína recombinante em uma escala maior. A detecção da proteína recombinante foi realizada por SDS-PAGE, Western Blotting e Dot Blotting. O planejamento Plackett-Burman foi aplicado para selecionar as variáveis significantes, que foram o pH e a adição de Sorbitol e aminoácidos no meio de cultura. Os dados obtidos passaram por análise estatística que permitiu esta seleção. O Delineamento Composto Central foi aplicado para uma análise em níveis maiores das variáveis significativas. Também foi feita uma caracterização de linhagem para que a colônia selecionada fosse caracterizada como uma linhagem produtora. Apesar das três variáveis terem sido significativas (pH, sorbitol e aminoácidos), apenas o aumento do valor de pH apresentou um efeito benéfico para a produção da rhG-CSF. Curvas de crescimento celular foram desenhadas, além do cálculo da velocidade máxima de crescimento e tempo de duplicação. Estes resultados mostram a produção da rhG-CSF em P. pastoris e estes são os primeiros passos para uma estratégia de tornar o Brasil um produtor deste biofármaco futuramente, além de contribuir para estudos de otimização de bioprocessos.
Título en inglés
Expression of human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) in Pichia pastoris and the optimization of the bioprocess
Palabras clave en inglés
Central composite design
Experimental design
G-CSF
Pichia pastoris
Plackett-Burman
Screening design
Resumen en inglés
The human granulocytic colony stimulating factor (hG-CSF) acts mainly by promoting the maturation of neutrophils. The hG-CSF has been used in the treatment of many diseases, in particular in neutropenic conditions. In Brazil, this medicine is inserted into the Pharmaceutical Assistance Program of the National Health Care System as an exceptional drug, but it has a high cost on purchasing because it is still not produced here. A study of technical and economic feasibility of the implementation of hG-CSF production in Brazil has shown that this drug can be produced by costs up to 90% lower than the amounts paid in government procurement. This work shows the cloning and expression of rhG-CSF in heterologous P. pastoris system and the best parameters for it, under different culture conditions, as well as a characterization of the producing line of recombinant protein. The expression plasmid was constructed with the pPICZαA vector and confirmed by nucleotide sequencing. After transformation into P. pastoris some colonies were tested to evaluate the expression conditions of the recombinant protein. The colony that presented a higher expression level was chosen to produce the recombinant protein in a larger scale. Detection of the recombinant protein was performed by SDS-PAGE, Western Blotting and Dot Blotting. The steps of cloning and screening the transformants were successfully performed. Plackett-Burman planning was applied to select the significant variables, which were the pH and the addition of sorbitol and amino acids in the culture medium. The data obtained underwent statistical analysis that allowed this selection. The statistically significant variables were chosen and the Central Composite Design was applied for an analysis at higher levels of the significant variables. A lineage characterization was done so that the selected colony was characterized as a producer lineage. Although all three variables were significant (pH, sorbitol and amino acids) only the increase in pH had a beneficial effect on rhGCSF production. Cell growth curves were made in addition to calculating the maximum growth time and doubling time. These results show the feasibility of rhG-CSF production in P. pastoris and this is the first step for the strategy to produce this biopharmaceutical in Brasil in a near future. In addition, the results contribute to the bioprocess optimization studies.
 
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Fecha de Publicación
2021-04-09
 
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