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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2016.tde-23052018-154005
Documento
Autor
Nombre completo
Nathália Cristina Canicoba
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2016
Director
Tribunal
Machado, Cleni Mara Marzocchi (Presidente)
Castelo, Ademilson Panunto
Valim, Yara Maria Lucisano
Título en portugués
Ativação in vitro de neutrófilos via CR3: implicações da variante da cadeia do CD11b (rs1143679) para as interações com o endotélio
Palabras clave en portugués
CR3
Endotélio
Mieloperoxidase
Neutrófilos
Resumen en portugués
O neutrófilo é o leucócito predominante na circulação sanguínea. Por ser um fagócito profissional e conter grânulos ricos em enzimas digestivas, ele representa a primeira linha de defesa contra infecções. A principal proteína dos seus grânulos é a mieloperoxidase (MPO), a qual contribui para a atividade microbicida do neutrófilo por mediar a geração de moléculas oxidantes que degradam inúmeras estruturas biológicas dos patógenos, mas que podem também agredir o próprio hospedeiro. A ação deletéria da MPO está relacionada com processos inflamatórios que causam danos ao endotélio e sustentam a inflamação. A liberação da MPO do neutrófilo diretamente sobre o endotélio depende da interação célula-célula mediada pela integrina CD11b/CD18 (receptor tipo 3 para o complemento, CR3) expressa nos neutrófilos e pela molécula de adesão intercelular (ICAM-1) no endotélio, sugerindo o envolvimento do CR3 em no dano tecidual na inflamação crônica. Um polimorfismo no gene ITGAM (integrin, alpha M), que codifica a integrina CD11b (αM) do CR3 influencia a interação do CR3 com seus ligantes e prejudica a adesão celular. Há poucos estudos funcionais sobre esta variante, sendo a maioria em células transfectadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar as implicações da variante da cadeia CD11b do CR3 para as interações neutrófilo-endotélio. Os genótipos para identificação das variantes alélicas foram determinados por reação em cadeia da polimerase; as células endoteliais (CE) extraídas da veia do cordão umbilical foram expostas aos neutrófilos expressando as variantes 77R e 77H, os quais foram estimulados ou não com Zimosan, imunocomplexos com F(ab')2 - ambos opsonizados com soro humano normal (SHN) e tratados com soro humano inativado (SHI) - e o formil-metil-leucil-fenilalanina (fMLP); a agressão às CE foi avaliada por medida da peroxidação lipídica pelo método de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; a transferência de MPO dos neutrófilos para as CE foi analisada por citometria de fluxo com anticorpo monoclonal específico; a avaliação da ativação endotelial foi avaliada pela liberação de ICAM-1 por ensaio imunoenzimático. Os resultados mostraram que i) os neutrófilos com a variante 77H, sem estímulos, causaram maior agressão ao endotélio, com maior peroxidação lipídica, quando comparada àquela de neutrófilos com a variante R77; ii) a peroxidação lipídica foi maior quando os neutrófilos responderam aos estímulos opsonizados com SHN; iii) os neutrófilos com a variante 77R produziram maior peroxidação lipídica com o estímulo F(ab')2/SHN comparados aos neutrófilos com 77H; iv) a transferência de MPO para as células endoteliais é dependente da disponibilidade do CR3 e do contato com o neutrófilo; v) os estímulos dependentes do CR3 promoveram um aumento da ativação endotelial medida pela concentração de ICAM-1 solúvel; a remoção do complemento (SHI) minimiza esta ativação; vi) o modelo permitiu observar a dependência do CR3 para todas a funções estudadas. Os resultados refletem a diversidade de mecanismos envolvidos nas interações estudadas e apontam para a necessidade do refinamento dos modelos experimentais para uma compreensão mais clara. A partir deste modelo podemos pensar em delineamentos envolvendo neutrófilos de pacientes com LES, bem como estudar potenciais drogas moduladoras das respostas envolvendo o CR3.
Título en inglés
In vitro activation of neutrophils via CR3: implications of the CD11b chain variant (rs1143679) for interactions with the endothelium
Palabras clave en inglés
CR3
Endothelium
Myeloperoxidase
Neutrophil
Resumen en inglés
Neutrophil is the most abundant leukocyte in circulation. It is the first line of defense against infections, mainly due to their granules full of digestive enzymes. The main protein of its granules is myeloperoxidase (MPO), which contributes to the microbicidal activity of neutrophils by mediating the generation of reactive oxygen molecules. However, MPO may also harm the host itself: MPO is involved in inflammation and tissue damage. The release of MPO directly on the endothelium is dependent of neutrophil-endothelium interaction. This is mediated by the interaction of the integrin CD11b/CD18 (complement receptor type 3, CR3) expressed by neutrophils and the intercellular adhesion molecule (ICAM-1) in the endothelium. A polymorphism in the ITGAM gene (integrin alpha M), which codifies CD11b integrin (αM) of CR3 impairs both the interaction with its ligands and cell adhesion. There are few functional studies assessing this variant, the majority in transfected cells. In this way, the aim of this study was to evaluate the implications of CD11b chain variant of CR3 for neutrophil-endothelium interactions. Allelic variants were determined by polymerase chain reaction; endothelial cells (EC) extracted from the umbilical vein were exposed to neutrophils expressing variants 77R or 77H, which were stimulated or not with Zimosan, immunocomplexes with F (ab') 2 - both opsonized with normal human serum (NHS) or treated with inactivated human serum (SHI) - and formil-methyl-leucyl-phenylalanine (fMLP); aggression to the EC was evaluated by measuring lipid peroxidation by reactive substances to thiobarbituric acid method; Transfer of MPO from neutrophils to EC was analyzed by flow cytometry with specific monoclonal antibody; assessment of endothelial activation was evaluated by of ICAM-1 release by immunoenzymatic method. The results show that i) neutrophils bearing 77H variant without stimuli caused increased lipid peroxidation compared to neutrophils bearing R77 variant in homozygosis; ii) lipid peroxidation was increased when neutrophils were stimulated with stimuli opsonized by SHN; iii) neutrophils stimulated with F(ab')2 / SHN bearing 77R variant had increased lipid peroxidation compared to neutrophils bearing 77H; iv) the MPO transfer to endothelial cells is dependent on the availability of CR3 and contact with neutrophils; v) CR3-dependent stimuli promoted an increase in endothelial activation measured by soluble ICAM-1; complement removal (HIS) minimizes this activation; vi) the model allowed us to observe the dependence of CR3 for all the studied functions. The results reflect the diversity of mechanisms involved in the studied interactions and point to the need for refinement of experimental models for a more clarifying understanding from this model we can think of designs involving patients with SLE neutrophils, as well as studying potential modulatory drug responses involving CR3.
 
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Fecha de Liberación
2020-05-22
Fecha de Publicación
2021-04-09
 
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