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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2017.tde-23052017-142507
Document
Auteur
Nom complet
Karina Stringhetta Padovani
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
Ribeirão Preto, 2017
Directeur
Jury
Leopoldino, Andréia Machado (Président)
Gomes, Marcelo Damario
Farias, Kelen Cristina Ribeiro Malmegrim de
Saad, Sara Teresinha Ollala
Traina, Fabíola
Titre en portugais
Análise da proteína hnRNP K nas linhagens celulares NB4 e NB4-R2 de leucemia promielocítica aguda com ênfase na patogênese e na diferenciação celular pelo ácido all-trans retinoico
Mots-clés en portugais
ATRA
Diferenciação celular
hnRNP K
LPA
SET
Resumé en portugais
A ribonucleoproteína heterogênea nuclear K (hnRNP K) e o inibidor endógeno da fosfatase 2A (SET) são superexpressos e propostos como marcadores prognósticos em leucemia mieloide aguda e crônica. O objetivo do estudo foi caracterizar a participação das proteínas hnRNP K e SET na leucemogênese da leucemia promielocítica aguda (LPA), assim como na diferenciação celular induzida pelo ácido all-trans retinóico (ATRA). Os resultados iniciais de qRT-PCR demonstram que os níveis de RNAm de HNRNPK e SET estão aumentados em pacientes ao diagnóstico de LPA em comparação com amostras de indivíduos saudáveis e diminuem após indução e durante a manutenção do tratamento. Os resultados foram validados por Western blot, sugerindo hnRNP K e SET como marcadores diagnóstico e de resposta ao tratamento. O knockdown de hnRNP K e SET foi realizado em células de LPA sensível, NB4, e resistente ao ATRA, NB4-R2, utilizando RNA de interferência. Ambas as proteínas também foram testadas como alvo terapêutico com a utilização de inibidores de hnRNP K (U0126) e SET (OP449 e FTY720). A diminuição de hnRNP K nas células levou ao aumento da diferenciação celular granulocítica em ambas as células, principalmente na presença de ATRA, e portanto, foi capaz de reverter o fenótipo de resistência ao ATRA das células NB4-R2. O knockdown de hnRNP K, assim como o tratamento com U0126, levou a perda de viabilidade dessas células por indução de apoptose acompanhada da clivagem da proteína SET. O knockdown de SET em células LPA confirmou que a indução de apoptose em células com knockdown de hnRNP K ocorreu por clivagem e não pela diminuição da proteína SET nas células. Além disso, demonstrou também que SET prejudica a atuação do ATRA no processo de diferenciação celular. O modelo in vivo utilizando transplante de NB4-R2 em camundongos nude confirmou que o trióxido de arsênico (ATO) combinado a U0126 tem um maior potencial contra a progressão tumoral quando comparado ao tratamento isolado com ATO. FTY720 e OP449 tiveram efeito anti-leucêmico significativo com redução da viabilidade celular. Quando em associação, FTY720 e OP449, apresentaram efeito sinérgico significativo em NB4-R2 (CID<0,7). Concluímos que a superexpressão de hnRNP K e SET contribui para o bloqueio da diferenciação celular em promielócitos e prejudicam a atuação do ATRA no tratamento da LPA e, portanto, hnRNPK em associação com a proteína SET representam alvo terapêutico em potencial para terapia anti-leucêmica da LPA, principalmente para pacientes resistentes ao ATRA
Titre en anglais
Analysis of hnRNPK protein in cell lines NB4 and NB4-R2 of acute promyelocytic leukemia with emphasis in pathogenesis and cell differentiation by all-trans retinoic acid
Mots-clés en anglais
APL
ATRA
Cell differentiation
hnRNP K
SET
Resumé en anglais
Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K (hnRNP K) and endogenous inhibitor of phosphatase 2A (SET) are overexpressed and proposed as prognostic markers in acute and chronic myeloid leukemia. The study aim was to characterize the hnRNP K and SET proteins involvement in acute promyelocytic leukemia leukemia (APL) leukemogenesis as well as all-trans retinoic acid (ATRA) induced cell differentiation. Initial qRT-PCR results demonstrate that HNRNPK and SET mRNA levels are increased in patients diagnosed with APL compare to samples from healthy donors and decrease after induction and during maintenance of treatment. The results were validated by Western blot, suggesting hnRNP K and SET as diagnostic and response to treatment markers. The knockdown of hnRNP K and SET was performed on sensitive, NB4, and ATRA-resistant, NB4-R2, LPA cells using interfering RNA. Both proteins were also tested as a therapeutic target with a use of hnRNP K (U0126) and SET inhibitors (OP449 and FTY720). The decrease of hnRNP K in cells led to increased granulocyte cell differentiation in both cells, especially in the presence of ATRA, and thus was able to reverse the NB4-R2 cells resistance to ATRA phenotype. The hnRNP K knockdown, as well as the treatment with U0126, had a loss of cell viability by induction of apoptosis accompanied by cleavage of the SET protein. The SET knockdown in APL cells confirmed that an induction of apoptosis in cells with hnRNP K knockdown occurred by cleavage and not by the SET protein decrease in the cells. Furthermore, it has also shown that SET impairs the ATRA's performance in the cellular differentiation process. The in vivo model using NB4-R2 transplant in nude mice confirmed that arsenic trioxide (ATO) combined with U0126 has a greater potential against tumor progression compared to the treatment isolated with ATO. FTY720 and OP449 have significant anti-leukemic effect reducing cell viability. When in combination, FTY720 and OP449, they had a significant synergistic effect on NB4-R2 (CDI <0.7). We conclude that overexpression of hnRNP K and SET contributes to block cell differentiation in promyelocytes and impair the performance of ATRA in the treatment of APL and therefore hnRNPK in association with a SET protein represent a potential therapeutic target for anti-leukemic therapy of APL, mainly for patients resistant to ATRA
 
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Date de Libération
2021-05-23
Date de Publication
2017-07-28
 
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