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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.60.2017.tde-07082017-111649
Documento
Autor
Nome completo
Priscilla Mariane Cardoso Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2017
Orientador
Banca examinadora
Frantz, Fabiani Gai (Presidente)
Prado Junior, Jose Clovis do
Bonato, Vania Luiza Deperon
Melicio, Luciane Alarcão Dias
Título em português
Plasticidade dos neutrófilos durante a infecção por Mycobacterium tuberculosis está relacionada com a progressão da doença humana
Palavras-chave em português
Mycobacterium tuberculosis
Neutrófilos
Plasticidade
Tuberculose
Resumo em português
A tuberculose é uma doença infecciosa, causada pela Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que afeta um terço da população mundial, sendo que o hospedeiro infectado pode desenvolver tanto a forma ativa quanto latente da infecção. Juntamente com os macrófagos residentes, os neutrófilos parecem ser importantes no controle da infecção por Mtb e formação de granulomas no pulmão. Recentemente, alguns estudos estão quebrando paradigmas sobre os neutrófilos, revelando que em algumas situações como em câncer, essas células podem ser polarizadas para os perfis N1 e N2, associados respectivamente às respostas anti-tumoral e pró-tumoral. Estas descobertas abriram uma perspectiva diferente no estudo de infecções, inclusive na tuberculose. Assim, a hipótese deste trabalho é que a polarização dos neutrófilos nos perfis N1 e N2 pode influenciar o controle da infecção por Mtb, e portanto nosso objetivo foi avaliar como estes diferentes perfis estão relacionados com a patogênese da doença humana. Os neutrófilos foram isolados a partir de sangue periférico de 17 voluntários que não apresentavam a infecção ativa por Mtb. Estas células foram polarizadas in vitro com GM-CSF + IFN-γ para diferenciação no perfil N1 ou com IL-4 + IL-13 + TGF-β para diferenciação no perfil N2. Os neutrófilos polarizados foram caracterizadas por análise morfológica, produção de espécies reativas de oxigênio e expressão gênica. Neutrófilos N1 e N2 foram então infectados in vitro por Mtb e a capacidade fagocítica e microbicida, bem como a liberação de NETs e a produção de citocinas foram analisadas. Os neutrófilos de pacientes com tuberculose ativa foram avaliados quanto a expressão de genes correlacionados aos perfis N1 e N2 e estabelecidas correlações com a gravidade da doença. Quando os neutrófilos foram desafiados com Mtb, o perfil N1 apresenta aumento de IL-8, IL-1-β, IFN-γ e a formação de NETs. Em contraste, o perfil de N2 apresentou menor produção destas citocinas inflamatórias, mas de forma evidente, aumento de IL-4 e TGF-β. Além disso, na condição N2 não foi possível observar a formação de NETs. Curiosamente, avaliando a atividade microbicida, quando os neutrófilos são polarizados, infectados por Mtb e co-cultivados com PBMC, os mediadores liberados por N1 e N2 potencializam a capacidade dos monócitos em eliminar a micobactéria. Adicionalmente, neutrófilos de 19 pacientes com tuberculose ativa foram avaliados quanto a expressão gênica, e comparadas à expressão dos neutrófilos de indivíduos não infectados. A expressão dos genes TLR4, LCN2 e Dectin1 estava diminuída em neutrófilos de pacientes com tuberculose e expressão do gene CCR7 foi correlacionada negativamente com a progressão da tuberculose, de modo que a maior expressão de CCR7 está relacionada à menor gravidade da doença. A expressão gênica também mostrou diferenças no perfil dos neutrófilos durante as distintas fases de ativação por Mtb. Este resultado reforça a ideia de plasticidade dos neutrófilos de acordo com o microambiente e ajuda a entender melhor como os subtipos de neutrófilos podem ter diferentes ações contra Mtb. Além disso, indica que os N2 estão mais relacionados com a doença na sua fase mais grave, impedindo a resolução ideal da infecção que estaria associada ao perfil N1.
Título em inglês
Neutrophils plasticity during Mycobacterium tuberculosis infection is related to the human disease progression
Palavras-chave em inglês
Mycobacterium tuberculosis
Neutrophils
Plasticity
Tuberculosis
Resumo em inglês
Tuberculosis is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), which affects one-third of the world's population, and the infected host can develop both active and latent forms of the infection. Together with resident macrophages, neutrophils appear to be important in the control of Mtb infection and in the formation of granulomas in the lung. Recently. Some studies are breaking paradigms about neutrophils, revealing that in some situations such as cancer, these cells can be polarized to the N1 and N2 profiles, respectively associated with anti-tumor and pro-tumor responses. These findings opened a new perspective on the study of infections, including tuberculosis. Thus the hypothesis of this work is that neutrophil polarization in the N1 and N2 profiles may influence the control of Mtb infection, and hence our objective was to evaluate how these different profiles are related to the pathogenesis of the human disease. Neutrophils were isolated from peripheral blood of 17 healthy volunteers and 19 patients with active tuberculosis. Cells from healthy volunteers were polarized with GM-CSF + IFN-γ for differentiation in the N1 profile, or with IL-4 + IL-13 + TGF-β for differentiation in the N2 profile. Polarized neutrophils were characterized by morphological analysis, production of reactive oxygen species, and gene expression. Neutrophils N1 and N2 were then infected in vitro by Mtb and the phagocytic and microbicidal capacity, as well as the release of NETs and the production of cytokines were analyzed. Neutrophils from patients with active tuberculosis were evaluated for expression of genes correlated to N1 and N2 profiles and established correlations with disease severity. When neutrophils were challenged with Mtb, the N1 group showed an increase in IL-8, IL-1-β, IFN-γ and formation of NETs. In contrast, the N2 profile reveals a subtle production of these inflammatory cytokines, but clearly, increased IL-4 and TGF-β. Furthermore, in the (N2) condition it was not possible to observe the formation of NETs. Interestingly, evaluating microbicidal activity, when neutrophils are polarized, infected by Mtb and co-cultured with PBMC, the mediators released by N1 and N2 potentiate the ability of monocytes to eliminate mycobacteria. On the other hand, gene expression of neutrophils from patients with tuberculosis showed a decrease in TLR4, LCN2 and Dectin1 genes. CCR7 showed a negative correlation with the progression of tuberculosis, so that the greater expression of CCR7 is related to the lower severity of the disease. Gene expression also showed differences in neutrophil profile during the different stages of activation by Mtb. This result reinforces the idea of plasticity of neutrophils according to the microenvironment and helps to better understand how neutrophil subtypes may have different actions against Mtb. In addition, it also indicates that N2 is more related to the disease in its most severe phase, preventing the ideal resolution of the infection that would be associated to the N1 profile
 
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Data de Liberação
2019-08-07
Data de Publicação
2021-04-12
 
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