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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2020.tde-29062021-153652
Documento
Autor
Nombre completo
Camila Alessandra Mini
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
Ribeirão Preto, 2020
Director
Tribunal
Oliveira, Danielle Palma de (Presidente)
Antunes, Lusania Maria Greggi
Cordeiro, Lorena Rigo Gaspar
Leme, Daniela Morais
Título en portugués
Estabelecimento de um modelo de epiderme em 3D proveniente de células imortalizadas a ser utilizado como plataforma de avaliação da toxicidade dérmica induzida por corantes de tinturas capilares
Palabras clave en portugués
Células HaCaT
Citotoxicidade
Corrosão
Epiderme humana equivalente
Exposição dérmica
Genotoxicidade
Irritação
Resumen en portugués
Com a adoção de métodos alternativos ao uso de animais na comunidade científica, diversos grupos trabalharam para o desenvolvimento de novos modelos capazes de ser aplicados na avaliação da toxicidade de substâncias/produtos. Tratando-se de exposição dérmica, os modelos de pele/epiderme reconstruída foram desenvolvidos no mundo todo, porém a aquisição desses modelos no Brasil é bastante dificultosa. Devido a isso, o objetivo aqui proposto foi o desenvolvimento de um modelo tridimensional de epiderme, utilizando queratinócitos imortalizados (HaCaT-EHE) para aplicação na avaliação de toxicidade de corantes presentes em tinturas capilares, além da comparação dos efeitos com a cultura celular em monocamada. Após a construção do modelo tridimensional, foi avaliada a diferenciação celular por métodos histológicos/imunohistoquímicos, validação do método analítico de determinação do sal de formazan utilizado nos testes de corrosão e irritação. Foi verificada a permeabilidade da membrana e proficiência do modelo em diferenciar substâncias irritantes, não irritantes, corrosivas e não corrosivas. Para avaliação de endpoints de toxicidade foram realizados ensaio de genotoxicidade (ensaio do Cometa), viabilidade/citotoxicidade (MTT, teste de viabilidade celular por anexina V/PI e teste de Tunel) e irritação e corrosão. O modelo apresentou diferenciação celular e expressão dos biomarcadores de desenvolvimento das camadas, além disso apresentou permeabilidade de membrana semelhante aos modelos já validados. O método para a determinação do sal de formazan mostrou ser seletivo, exato, preciso e robusto. Além disso, apresentou um índice de recuperação superior a 85% e variação inferior a 15%, e não foi observada a presença resíduos do sal após uma injeção com concentração elevada. Adicionalmente, o modelo demonstrou boa predição para irritação (seletividade 100%, especificidade 75% e exatidão 90%) e também para corrosão (seletividade 100%, especificidade 100% e exatidão 100%) para as substâncias testadas. Quanto aos corantes, o Basic Blue 99 (BB99) não demonstrou efeitos genotóxicos em ambos modelos, porém, demonstrou queda na viabilidade celular, além de intensa marcação com PI e dupla marcação (anexina e PI) indicando morte celular por necrose no modelo 2D. No modelo 3D, observou-se intensa marcação com fluoresceína em todas as concentrações testadas, indicando ocorrência apoptose. Como esperado, o BB99 se mostrou irritante após a exposição por 30 minutos, embora não tenha induzido a efeito corrosivo. Já o corante Basic Red 51 (BR51) induziu a efeitos genotóxicos em ambos os modelos, além disso provocou queda na viabilidade celular no modelo 2D e no modelo 3D induziu a marcação com a fluoresceína. O corante não apresentou efeitos irritantes e corrosivos. Frente ao exposto, podemos concluir que o modelo apresentou boa predição e pode ser utilizado como plataforma de estudos de avaliação da segurança/toxicidade de produtos após a exposição dérmica. Os corantes testados demonstraram efeitos tóxicos em concentrações inferiores ao limite recomendado pelo Comitê Científico Europeu e, desta forma, a utilização em produtos comerciais de tinturas capilares deveria ser revista.
Título en inglés
Establishment of a tested 3D epidermis model of an immortalized cells as a platform for assessing dermal toxicity induced by hair dyes
Palabras clave en inglés
Corrosion
Cytotoxicity
Dermal exposure
Equivalent human epidermis
Genotoxicity
HaCaT cells
Irritation
Resumen en inglés
With the adoption of alternative methods to the use of animals in the scientific community, several groups worked towards the development of new models capable of being applied in the evaluation of the toxicity of substances / products. In the case of dermal exposure, the reconstructed skin / epidermis models were developed worldwide, but the acquisition of these models in Brazil is quite difficult. Because of this, the objective proposed here was the development of a three-dimensional model of epidermis, using immortalized keratinocytes (HaCaT-EHE) for application in the evaluation of toxicity of dyes present in hair dyes, in addition to comparing the effects with cell culture in monolayer . After building the three-dimensional model, cell differentiation was evaluated by histological / immunohistochemical methods, validation of the analytical method for determining formazan salt used in corrosion and irritation tests. The permeability of the membrane and the proficiency of the model in differentiating irritating, non-irritating, corrosive and non-corrosive substances were verified. For evaluation of toxicity endpoints, genotoxicity assay (Comet assay), viability / cytotoxicity (MTT, cell viability test by annexin V / PI and Tunel test) and irritation and corrosion were performed. The model showed cell differentiation and expression of the biomarkers of development of the layers, in addition it presented membrane permeability similar to the models already validated. The method for determining formazan salt has proven to be selective, accurate, precise and robust. In addition, it had a recovery rate greater than 85% and variation less than 15%, and the presence of salt residues was not observed after an injection with high concentration. In addition, the model demonstrated good prediction for irritation (100% selectivity, 75% specificity and 90% accuracy) and also for corrosion (100% selectivity, 100% specificity and 100% accuracy) for the tested substances. As for the dyes, Basic Blue 99 (BB99) did not demonstrate genotoxic effects in both models, however, it showed a decrease in cell viability, in addition to intense staining with PI and double staining (annexin and PI) indicating cell death by necrosis in the 2D model. In the 3D model, intense fluorescein staining was observed at all concentrations tested, indicating apoptosis. As expected, BB99 was irritating after exposure for 30 minutes, although it did not induce a corrosive effect. The Basic Red 51 (BR51) dye induced genotoxic effects in both models, in addition it caused a drop in cell viability in the 2D model and in the 3D model it induced fluorescein staining. The dye had no irritating or corrosive effects. In view of the above, we can conclude that the model presented a good prediction and can be used as a platform for evaluating the safety / toxicity of products after dermal exposure. The dyes tested demonstrated toxic effects at concentrations below the limit recommended by the European Scientific Committee and, therefore, the use in commercial hair dye products should be reviewed.
 
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Fecha de Liberación
2023-06-29
Fecha de Publicación
2021-07-12
 
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