O carvedilol é um betabloqueador não seletivo de terceira geração utilizado no tratamento de doenças como hipertensão, angina pectoris, arritmia cardíaca e insuficiência cardíaca congestiva. É comercializado como uma mistura racêmica dos enantiômeros (S)-(-) e (R)-(+). O carvedilol é amplamente utilizado em pacientes submetidos à cirurgia bariátrica, no período anterior e posterior a cirurgia. Entretanto, uma das consequências dessa cirurgia é o comprometimento da absorção de nutrientes e fármacos. Sendo assim a determinação da concentração plasmática do carvedilol nestes pacientes é de grande importância para realizar o ajuste de dose. A maioria dos métodos descritos na literatura para a quantificação do carvedilol em amostras de plasma utiliza técnicas de preparo de amostras como a precipitação de proteínas, a extração líquido-líquido, a extração em suporte sólido, a microextração líquido-líquido dispersiva e a extração em fase sólida. Até o momento não foi relatado nenhum método usando a extração líquido-líquido assistida por salting out (SALLE). Assim, o objetivo desse trabalho foi desenvolver e validar um método para análise dos enantiômeros do carvedilol em plasma humano usando a SALLE e análise por LC-MS/MS e aplicar esse método em amostras de plasma de pacientes do HCFMRP/USP submetidos à cirurgia bariátrica. A seleção do solvente orgânico e solução salina, a serem utilizadas na extração, foi feita baseada em testes qualitativos. A identificação dos parâmetros que influenciam na eficiência da SALLE foi feita empregando um planejamento fatorial fracionário 24-1 com 4 fatores. Posteriormente foi empregado um delineamento composto central (CCD) para otimizar a condição ótima de extração. A separação cromatográfica dos enantiômeros do carvedilol e metabólitos foi realizada em uma coluna Chirobiotic V/Astec (0,46x25cmx 5 μm) acoplada a uma coluna de guarda Lichrospher 100 RP-18 (5uM, 4x4 mm). A fase móvel foi composta por uma mistura de metanol:etanol (90:10 , v/v) e 0,02% de dietilamina e 0,18% ácido acético , em uma temperatura de 21oC e vazão 0,6 mL/min. Foi utilizado o modo positivo de ionização por eletrospray (ESI+) e as transições avaliadas foram m/z 407 → 100 para o carvedilol e m/z 235 → 86 para a lidocaína. A acetonitrila foi selecionada como solvente orgânico em conjunto com o sal acetato de amônio. O gráfico de Pareto feito com o software Minitab ® foi utilizado para identificar os fatores significativos para incluir no CCD. Os gráficos de superfície e o teste de desejabilidade feitos com o software Statistica ® foram utilizados para definir as condições ótimas de extração, as quais foram 500 μL de plasma, 1268 μL de acetonitrila, 384 μL da solução de acetato de amônio em uma concentração de 5 mol/L e 10 min de centrifugação. Nesta condição foi possível obter uma recuperação de 93% para ambos enantiômeros do carvedilol. O método desenvolvido foi validado seguindo os guias da ANVISA (2012) e EMA (2011) e apresentou seletividade, linearidade na faixa de 0,5 a 100 ng/mL, sendo 0,5 ng/mL o limite inferior de quantificação, precisão e exatidão. Não foi observado efeito residual e efeito matriz, e os enantiômeros do carvedilol apresentaram estabilidade em plasma após submetidos a diferentes condições de armazenamento, preparo e análise. Finalmente, o método validado foi aplicado com sucesso em amostras de plasma de pacientes do HCFMRP/USP que foram submetidos a cirurgia bariátrica, assim o método proposto atingiu o objetivo inicial.

Carvedilol is a third-generation non-selective beta-blocker used to treat diseases such as hypertension, angina pectoris, cardiac arrhythmia, and congestive heart failure. It is marketed as a racemic mixture of the (S)-(-) and (R)-(+) enantiomers. Carvedilol is widely used in patients undergoing bariatric surgery, in the period before and after surgery. However, one of the consequences of this surgery is the compromised absorption of nutrients and drugs. So the determination of the plasma concentration of carvedilol in these patients is very important to make the dose adjustment. Most of the methods described in the literature for the quantification of carvedilol in plasma samples use sample preparation techniques such as protein precipitation, liquid-liquid extraction, solid support extraction, dispersive liquid-liquid microextraction and extraction in solid phase. To date, no method using salting out assisted liquid-liquid extraction (SALLE) has been reported. Thus, the objective of this work was to develop and validate a method for the analysis of carvedilol enantiomers in human plasma using SALLE and LC-MS/MS analysis and apply this method in plasma samples from HCFMRP/USP patients undergoing bariatric surgery. The selection of the organic solvent and saline solution to be used in the extraction was based on qualitative tests. The identification of the parameters that influence the efficiency of SALLE was carried out using a fractional factorial design 24-1 with 4 factors. Later, a central composite design (CCD) was used to optimize the optimal extraction condition. The chromatographic separation of carvedilol enantiomers and metabolites was performed on a Chirobiotic V/Astec column (0.46x25cmx 5 μm) coupled to a Lichrospher 100 RP-18 guard column (5μM, 4x4 mm). The mobile phase was composed of a mixture of methanol:ethanol (90:10, v/v) and 0.02% of diethylamine and 0.18% acetic acid, at a temperature of 21oC and a flow rate of 0.6 mL/min. The positive mode of electrospray ionization (ESI+) was used and the transitions evaluated were m/z 407 → 100 for carvedilol and m/z 235 → 86 for lidocaine. Acetonitrile was selected as the organic solvent together with the ammonium acetate salt. The Pareto chart made with Minitab ® software was used to identify the significant factors to include in the CCD. Surface graphs and the desirability test done with the Statistica ® software were used to define the optimal extraction conditions, which were 500 μL of plasma, 1268 μL of acetonitrile, 384 μL of ammonium acetate solution at a concentration of 5 mol/L and 10 min of centrifugation. In this condition it was possible to obtain a 93% recovery for both enantiomers of carvedilol. The developed method was validated following guidelines of ANVISA (2012) and EMA (2011) and presented selectivity, linearity in the range of 0.5 to 100 ng/mL, with 0.5 ng/mL being the lower limit of quantification, precision and accuracy. Residual effect and matrix effect were not observed, and carvedilol enantiomers showed stability in plasma after being submitted to different storage, preparation and analysis conditions. Finally, the validated method was successfully applied to plasma samples from patients at HCFMRP/USP who underwent bariatric surgery, thus the proposed method achieved its initial objective.