As serinoproteases de peçonhas de serpentes (SVSPs) são enzimas capazes de afetar o sistema hemostático humano, dada sua semelhança com enzimas presentes em suas diferentes vias. Assim, são consideradas promissores agentes terapêuticos, além de potenciais ferramentas biotecnológicas. A PEGlação, processo no qual há a conjugação de polietilenoglicol (PEG) às proteínas, busca reduzir a imunogenicidade e aumentar a drogabilidade destas biomoléculas in vivo. Neste contexto, este trabalho objetivou a purificação de uma SVSP (collineina-1) da peçonha de Crotalus durissus collilineatus, bem como a expressão da sua forma recombinante (rCollineina-1) na levedura Pichia pastoris. Ambas as proteínas foram PEGladas (PEGcollineina-1 e PEG-rCollineina-1) e as características estruturais e funcionais, além da avaliação da resposta imune, foram comparadas entre as quatro formas da enzima. A collineina1 foi isolada da peçonha bruta através de dois passos cromatográficos em fase reversa, enquanto a rCollineina-1 foi purificada em três passos, em colunas de afinidade a íons metálicos imobilizados (IMAC) e troca catiônica. Em seguida, obteve-se uma população mono-PEGlada das proteínas. O modelo teórico da collineina-1 foi obtido utilizando a ferramenta SWISSMODEL, revelando que a proteína possui estrutura semelhante a outras SVSPs. A análise de estabilidade térmica indicou que todas as formas da proteína apresentam temperaturas de desenovelamento semelhantes. O pH 5,0 foi a condição com menor temperatura de desenovelamento, enquanto o pH 7,0 se caracteriza como a melhor condição para a estabilidade de todas as formas avaliadas da enzima. Foi observado um aumento significativo no tamanho das proteínas após a PEGlação (collineina-1: 4,0±0,4 nm, PEG-collineina-1: 9,9±1,1 nm, rCollineina-1: 4,9±1,3 nm; PEG-rCollineina-1: 10,7±1,3 nm). Por outro lado, não foram visualizadas mudanças expressivas no conteúdo de estruturas secundárias das enzimas. O conteúdo de alfa-hélices (7%, 5%, 2%, 15%), folhas beta (31%, 31%, 31%, 22%), giros (21%, 19%, 16%, 17%) e elementos sem conformação definida (41%, 45%, 51%, 46%) para a collineina-1, PEG-collineina-1, rCollineina-1 e PEG-rCollineina-1, respectivamente, evidenciam que a PEGlação não alterou de maneira significativa a conformação espacial das proteínas. A determinação dos parâmetros cinéticos apontou valores de Km semelhantes entre suas diferentes formas (collineina-1: 0,920±0,079 mM; rCollineina-1: 1,243±0,113 mM; PEGcollineina-1: 1,317±0,117 mM e PEG-rCollineina-1: 1,4±0,119 mM). No entanto, a constante catalítica (kcat) e a constante de especificidade (kcat/Km) foram ligeiramente diferentes. A rCollineina-1 apresentou valores mais elevados destes parâmetros (kcat=2,934±0,118 s-1 e kcat/Km = 2,4±0,115 mM.s-1 ) quando comparados à collineina-1 (kcat=0,497±0,017 s-1 e kcat/Km=0,5±0,048 mM.s-1 ), PEG-collineina-1 (kcat=0,502±0,020 s-1 e kcat/Km=0,4±0,068 mM.s1 ) e PEG-rCollineina-1 (kcat=1,286±0,050 s-1 e kcat/Km=0,9±0,084 mM.s-1 ). Estes resultados indicam que a PEGlação não foi prejudicial à atividade catalítica das formas nativa e recombinante, corroborando os resultados de degradação de fibrinogênio, os quais mostraram que todas as formas da enzima possuem atividade catalítica sobre esse substrato. Contudo, observou-se que a inibição do canal para potássio hEAG1 induzida pelas proteínas nativa e recombinante PEGladas foi significativamente menor que a inibição causada pelas enzimas não-PEGladas (45,5±13,4% para 8,2±4,7% e 50,3±6,0% para 5,7±3,7%, respectivamente, a 5 µM). Por outro lado, um aumento de atividade inibitória no hERG1 foi observado para a PEGcollineina-1 e PEG-rCollineina-1, com valores de IC50 de 22,4±1,1 µM e de 10,0±0,4 µM, respectivamente. Outras serinoproteases foram testadas em hEAG1 e os resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade destas enzimas neste canal foram propostos. A ausência de citotoxicidade em células PBMC e a inexistência de imunogenicidade in vivo avaliada em camundongos das proteínas PEGladas são resultados importantes na busca de uma aplicabilidade terapêutica. De maneira geral, a PEGlação destas proteínas direcionou sua atividade para o controle da hemostasia, ampliando as perspectivas de serem empregadas como agentes defibrinogenantes em condições patológicas como acidente vascular cerebral, trombose e embolia pulmonar.

Snake venom serinoproteases (SVSPs) are enzymes capable of affecting the human hemostatic system, given their similarity with enzymes present in its different pathways. Thus, they are considered promising therapeutic agents, in addition to potential biotechnological tools. PEGylation, a process in which polyethylene glycol (PEG) is conjugated to proteins, aims to reduce the immunogenicity and to increase the drugability of these biomolecules in vivo. In this context, this work aimed the purification of an SVSP (collinein-1) from Crotalus durissus collilineatus venom, as well as the expression of its recombinant form (rCollinein-1) in Pichia pastoris system. Both proteins were PEGylated (PEG-collinein-1 and PEG-rCollinein-1) and the structural and functional characterization, in addition to the evaluation of the immune response, were compared between the four forms of the enzyme. Collinein-1 was isolated from the crude venom by two reversed-phase chromatographic steps, while rCollinein-1 was purified in three steps, in columns of affinity to immobilized metal ions (IMAC) and cation exchange. Then, a mono-PEGylated population of both proteins was obtained. The modelling of collinein1 was obtained using the SWISS-MODEL tool, revealing that the protein has a structure like other SVSPs. The thermal stability analysis indicated that all forms of the protein have similar unfolding temperatures. PH 5.0 was the condition with the lowest unfolding temperature, while pH 7.0 was considered as the best condition for the stability of all forms of the enzyme. A significant increase in protein size was observed after PEGylation (collinein-1: 4.0±0.4 nm, PEG-collinein-1: 9,9±1,1 nm, rCollinein-1: 4.9±1.3 nm; PEG-rCollinein-1: 10,7±1,3 nm). On the other hand, no significant changes were seen in the content of secondary enzyme structures. The content of alpha-helixes (7%, 5%, 2%, 15%), beta sheets (31%, 31%, 31%, 22%), turns (21%, 19%, 16%, 17%) and random coil elements (41%, 45%, 51%, 46%) for collinein-1, PEGcollinein-1, rCollinein-1 and PEG-rCollinein-1, respectively, showed that PEGylation did not interfere in the protein folding. The determination of kinetic parameters showed similar values of Km between its different forms (collinein-1: 0.920 ± 0.079 mM; rCollinein-1: 1.243 ± 0.113 mM; PEG-collinein-1: 1.317 ± 0.117 mM and PEG-rCollinein-1: 1.4 ± 0.119 mM). However, the catalytic constant (kcat) and the specificity constant (kcat/Km) were slightly different. rCollinein-1 showed higher values of these parameters (kcat = 2.934 ± 0.118 s-1 and kcat/Km = 2.4 ± 0.115 mM.s-1 ) when compared to collinein-1 (kcat = 0.497 ± 0.017 s-1 and kcat/Km = 0.5 ± 0.048 mM.s-1 ), PEG-collinein-1 (kcat = 0.502 ± 0.020 s-1 and kcat / Km = 0.4 ± 0.068 mM.s-1 ) and PEG-rCollinein-1 (kcat = 1.286 ± 0.050 s-1 and kcat/Km = 0.9 ± 0.084 mM.s-1 ). However, these results indicate that PEGylation was not harmful to the catalytic activity of native and recombinant forms, corroborating the results of fibrinogen degradation, which showed that all forms of the enzyme have catalytic activity on this substrate. However, it was observed that the inhibitory activity of PEGylated proteins was significantly lower in the hEAG1 channel (45.5 ± 13.4% to 8.2 ± 4.7% and 50.3 ± 6.0% to 5.7 ± 3.7%, at 5 µM, for the native and recombinant proteins, respectively), while there was an increase in activity in hERG1, with IC50 values of 22.4 ± 1.1 µM and 10.0 ± 0.4 µM for PEG-collinein-1 and PEG-rCollinein-1, respectively. Other serinoproteases were tested on hEAG1 and the essential amino acid residues for the activity of these enzymes in this channel have been proposed. The absence of cytotoxicity in PBMC cells and the lack of in vivo immunogenicity evaluated in mice of PEGylated proteins are important results in the quest for therapeutic applicability. Overall, the PEGylation of these proteins directed their activity towards hemostasis control, broadening their possibilities to be used as defibrinogenant agents in pathological conditions such as stroke, thrombosis, and pulmonary embolism.