Peçonhas ofídicas apresentam alta complexidade de componentes e, para a elucidação de seus mecanismos de toxicidade, é necessário que os mesmos sejam isolados e caracterizados, para que sua ação durante o envenenamento se torne esclarecida, facilitando o tratamento do respectivo sintoma. Muitos componentes minoritários da peçonha de Crotalus durissus collilineatus ainda não foram estudados. A fosfodiesterase (PDE) já havia sido identificada na peçonha, mas não tinha sido isolada ou caracterizada. Enzimas da classe PDE são responsáveis pela quebra das ligações fosfodiéster de ácidos nucléicos, ATP, ADP, NAD, NGD, AMPc e GMPc, interferindo em processos fisiológicos ou patológicos, o que as tornam alvos terapêuticos de diversas patologias. Assim, os objetivos deste estudo foram o isolamento e a caracterização bioquímica, estrutural e funcional da PDE da peçonha de C. d. collilineatus (CdcPDE). O isolamento da CdcPDE foi realizado por combinação de técnicas de cromatografia líquida, como filtração molecular, trocas aniônica e catiônica, respectivamente, sendo seu rendimento <1%. Por SDS-PAGE, foi possível observar sua migração como um monômero e a presença de glicosilações na molécula. Por espectrometria de massas, a CdcPDE apresentou duas massas moleculares determinadas por MALDI-TOF, 100 e 105 kDa, e por LCMS/MS em união com o sequenciamento amino-terminal, foi possível determinar uma sequência para a CdcPDE, formada por 829 resíduos de aminoácidos. Por análises in silico, foi possível estimar as suas estruturas secundária e terciária, bem como a sua interação com o substrato bis(p-nitrofenil) fosfato. Utilizando este mesmo substrato, a CdcPDE apresentou maior atividade enzimática entre os pH 8 e 8,5, a 37 ºC, e a melhor temperatura para armazená-la foi 0 °C. Alguns agentes redutores e um quelante metálico inibiram a atividade enzimática de CdcPDE, sugerindo que as pontes dissulfeto em sua estrutura são essenciais para a atividade, bem como os íons metálicos, o que a caracteriza como uma metaloenzima. Os parâmetros cinéticos obtidos foram: Km = 0,38 mM, Vmáx = 0,7 μM/s, kcat = 0,14 s-1 e sua eficiência catalítica foi igual a 0,37 mM.s-1, mostrando alta afinidade pelo substrato utilizado, bem como, eficiência cinética, quando comparada a outras PDE oriundas de peçonhas ofídicas. Outros ensaios demonstraram que a CdcPDE reduz/perde atividade enzimática com a perda de água e em contato com TFA, e sua temperatura de desenovelamento foi de 65,71 ºC. Por ELISA, foi possível observar que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan reconhece a CdcPDE e, por análise in silico, foram identificados 16 possíveis epítopos imunogênicos na molécula. Por fim, foi possível observar que a CdcPDE inibe a agregação de plaquetas induzidas por ADP e é uma molécula citotóxica para queratinócitos humanos, apresentando valor de IC50 de 71,65 μg/mL. Esta ação nunca foi relatada para PDE de peçonhas ofídicas, sugerindo também, a possibilidade de efeitos locais destas moléculas durante o envenenamento. Assim, estas enzimas podem ser importantes ferramentas moleculares para a pesquisa, bem como, para a terapêutica, visto que apresentam funções bioquímicas capazes de interferir tanto com processos fisiológicos quanto patológicos.

Snake venoms present a high complexity of components and, in order to elucidate their toxicity mechanisms, it is necessary that they are isolated and characterized, so that their action during envenoming becomes clarified, facilitating the respective symptom treatment. Many minority components from Crotalus durissus collilineatus venom have not yet been studied. Phosphodiesterase (PDE) had already been identified in the venom, but had not been isolated or characterized. PDE enzymes class are responsible for breaking phosphodiester bonds of nucleic acids, ATP, ADP, NAD, NGD, cAMP and cGMP, interfering in physiological or pathological processes, which make them therapeutic targets for various pathologies. Thus, the objectives of this study were the isolation and biochemical, structural and functional characterization of the PDE from C. d. collilineatus venom (CdcPDE). The CdcPDE isolation was performed by combining liquid chromatography techniques, such as molecular filtration, anion and cation exchanges, respectively, with a yield <1%. Through SDS-PAGE, it was possible to observe its migration as a monomer and the presence of glycosylations in the molecule. By mass spectrometry, CdcPDE showed two molecular masses determined by MALDI-TOF, 100 and 105 kDa, and by LC-MS/MS in union with the amino-terminal sequencing, it was possible to determine CdcPDE sequence, consisting by 829 amino acid residues. By in silico analysis, it was possible to estimate their secondary and tertiary structures, as well as their interaction with the bis(p-nitrophenyl) phosphate substrate. Using this same substrate, CdcPDE showed greater enzymatic activity between pH 8 and 8.5, at 37 ºC, and the best temperature to store was 0 °C. Some reducing agents and a metal chelator inhibited the CdcPDE enzymatic activity, suggesting that the disulfide bridges in its structure are essential for the activity, as well as metal ions, which characterizes it as a metalloenzyme. Obtained kinetic parameters are: Km = 0.38 mM, Vmáx = 0.7 μM/s, kcat = 0.14 s-1 and its catalytic efficiency was equal to 0.37 mM.s-1, showing high affinity by the substrate used, as well as, kinetic efficiency, when compared to others snake venom PDE. Other assays demonstrated that CdcPDE reduces/loses enzymatic activity with water loss and in contact with TFA, and its unfolding temperature was 65.71 ºC. By ELISA, it was possible to observe that the anticrotalid serum produced by Instituto Butantan recognizes CdcPDE and, by in silico analysis, 16 possible immunogenic epitopes on the molecule were identified. Finally, it was possible to observe that CdcPDE inhibits platelet aggregation ADP-induced and it is a cytotoxic molecule for human keratinocytes, presenting an IC50 value of 71.65 μg/mL, and this action has never been reported for snake venoms PDE, also suggesting the possibility of local effects of these molecules during the envenoming. Thus, these enzymes can be important molecular tools for research, as well as, for therapy, since they have biochemical functions capable of interfering with both physiological and pathological processes.