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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.60.2013.tde-26022013-140519
Documento
Autor
Nome completo
Norival Alves Santos Filho
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
Ribeirão Preto, 2013
Orientador
Banca examinadora
Vilela, Suely (Presidente)
Oliveira, Fábio de
Nomizo, Auro
Rosa, Jose Cesar
Santos, Antonio Cardozo dos
Título em português
Caracterização funcional e estrutural de um inibidor de fosfolipase A2 tipo-α da serpente Bothrops alternatus: Clonagem, expressão e mapeamento da região responsável pela atividade inibitória
Palavras-chave em português
αBaltMIP
αPLI
Bothrops alternatus
rBaltMIP
Resumo em português
Mionecrose é uma importante complicação médica resultante de picadas de serpentes e, em casos graves, a mionecrose local pode levar a sequelas drásticas, como a perda de tecido permanente, incapacidade ou amputação do membro. As serpentes peçonhentas e não peçonhentas possuem na corrente sanguínea, proteínas inibidoras de fosfolipases A2 (PLA2s), denominadas PLIs. Uma hipótese que poderia explicar a presença desses PLIs no soro de serpentes peçonhentas seria a auto-proteção contra as enzimas da própria peçonha, que eventualmente, poderiam alcançar o sistema circulatório. No presente trabalho, uma proteína inibitória (denominada ?BaltMIP) que neutraliza as atividades enzimáticas e tóxicas de diversas PLA2s de peçonhas botrópicas foi isolada do plasma da serpente Bothrops alternatus por cromatografia de afinidade utilizando a miotoxina BthTX-I imobilizada em resina Sepharose CNBr ativada. Essa proteína apresentou massa molecular relativa de 24.000 em condições redutoras em SDS-PAGE e maior especificidade de inibição das atividades citotóxicas e miotóxicas das PLA2s símile Lys49 quando comparadas às atividades fosfolipásicas e anticoagulantes de PLA2s Asp49. Além disso, foi realizada a modelagem molecular, através de análises in silico, tanto da estrutura terciária, quanto da quaternária da ?BaltMIP. Ademais, um modelo de interação entre os alfas inibidores de miotoxinas e essas toxinas foi proposto, trazendo uma nova abordagem para o estudo com essas enzimas. Também foi realizada com sucesso a clonagem e expressão deste inibidor, denominado rBaltMIP em sua forma recombinante, sendo realizada em seguida sua caracterização bioquímica parcial. O sequenciamento N-terminal e HPLC de fase reversa mostraram que rBaltMIP foi purificado em um alto grau de pureza, apresentando 100% de identidade sequencial com o inibidor nativo. As propriedades inibitórias de rBaltMIP foram testadas frente às PLA2s e PLA2s-símiles. rBaltMIP foi capaz de inibir parcialmente a atividade fosfolipásica de diferentes enzimas, além de inibir a atividade miotóxica e citotóxica de diferentes PLA2 Lys49. A expressão heteróloga de rBaltMIP possibilitará a obtenção desse inibidor em grande escala, e consequentemente, a realização de trabalhos mais aprofundados no que diz respeito à possível elucidação do mecanismo de inibição das PLA2s de serpentes, o qual ainda não foi totalmente esclarecido. Além disso, novas informações em relação ao mecanismo de ação desses inibidores poderão ser conhecidas, na tentativa de melhor entender a aplicação destes, como novo modelo terapêutico com ação antiofídica na neutralização de diferentes tipos de PLA2s, na suplementação da soroterapia convencional e também na interação molecular com PLA2s.
Título em inglês
Functional and structural characterization of an α-type phospholipase A2 inhibitor from Bothrops alternatus: Cloning, expression and mapping of the region responsible for its inhibitory activity
Palavras-chave em inglês
αBaltMIP
αPLI.
Bothrops alternatus
rBaltMIP
Resumo em inglês
Myonecrosis is an important medical complication resulting from snakebites and, in severe cases, local myonecrosis can lead to drastic consequences such as permanent tissue loss, disability or limb amputation. Venomous and non-venomous snakes possess proteins that inhibit phospholipases A2 (PLA2s) in their bloodstream, called PLIs. One hypothesis that could explain the presence of these PLIs in the serum of venomous snakes would be the self-protection against their own venom enzymes, which could eventually reach the circulatory system. In the present work, an inhibitory protein (called ?BaltMIP) that neutralizes the enzymatic and toxic activities of several bothropic PLA2s was isolated from Bothrops alternatus plasma by affinity chromatography using the myotoxin BthTX-I immobilized on a CNBr-activated Sepharose resin. This protein showed relative molecular mass of 24,000 under reducing conditions on SDS-PAGE and greater specificity of inhibition of the cytotoxic and myotoxic activities of Lys49 PLA2-like enzymes compared to the anticoagulant and phospholipase activities of Asp49 PLA2s. In addition, molecular modeling was performed by in silico analysis of both tertiary and quaternary structures of ?BaltMIP. Furthermore, a model of interaction between alpha inhibitors of myotoxins and these toxins was proposed, bringing a new approach to the study of these enzymes. Cloning and expression of the inhibitor (called rBaltMIP in its recombinant form) were also achieved successfully, followed by its partial biochemical characterization. Nterminal sequencing and reverse phase HPLC showed that rBaltMIP was purified in a high purity degree, with 100% sequence identity with the native inhibitor. The inhibitory properties of rBaltMIP were tested against PLA2s and PLA2-like enzymes. rBaltMIP was able to partially inhibit the phospholipase activity of different enzymes, also inhibiting the cytotoxic and myotoxic activity of different Lys49 PLA2-like enzymes. Heterologous expression of rBaltMIP should help obtaining such inhibitor in large-scale, and consequently, the performance of further studies on the mechanism of inhibition of PLA2s, which has not yet been fully clarified. In addition, new information regarding the mechanism of action of these inhibitors may be known, in an attempt to better understand the application of these proteins as new therapeutic models with antiophidian action in neutralizing different types of PLA2s, the supplementation of conventional serum therapy and also in the molecular interaction with PLA2s.
 
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Tese_completa.pdf (4.68 Mbytes)
Tese_simplificada.pdf (253.79 Kbytes)
Data de Publicação
2013-03-08
 
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