Bisfenol A (BFA) e bisfenol S (BFS) são desreguladores endócrinos que podem levar ao desenvolvimento de diversos distúrbios metabólicos, tais como obesidade, diabetes e dislipidemias. No entanto os mecanismos associados aos efeitos tóxicos ainda não estão completamente elucidados. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo elucidar mecanismos de toxicidade do BFA e BFS, em modelos in vivo e in vitro, através de avaliações de alterações bioquímico-metabólicas e fisiopatológicas a partir da análise das vias metabólicas afetadas e por meio de ferramentas ômicas (proteômica e metabolômica). Para tanto, o trabalho foi dividido em 2 estudos principais: (I) Ratos machos Wistar foram cronicamente expostos (20 semanas) a doses aproximadas de 50 ou 500 μg/kg/dia de BFA e/ou BFS através da água de beber (aprovação ética n. 15.1.979.60.7). O ganho de massa corporal foi determinado semanalmente e testes de tolerância à insulina (TTI) e tolerância à glicose (TTG) foram realizados, respectivamente, nas 18ª e 19ª semanas de exposição. Após a eutanásia, amostras de sangue foram coletadas para a determinação de parâmetros bioquímicos em todos os grupos experimentais e amostras de fígado e pâncreas foram obtidas dos animais expostos a 50 μg/kg/dia de BFA ou BFS para quantificação de alterações na expressão de proteínas através de análises proteômicas nãodirecionadas por nanoUPLC-nanoESI-HDMSE (n=3) e na expressão gênica por experimentos de RT-qPCR (n=6). (II) células HepG2 e INS-1E foram expostas por 72 h a BFA ou BFS (100; 10; 1; 0,1; 0,01 e 0,001 μM) para determinação da proliferação e viabilidade celular e extratos polares intracelulares de ambas as linhagens foram obtidos após 24, 48 e 72 h de exposição a BFA ou BFS (10 - 0,001 μM) para a caracterização metabólica basal através de análises metabolômicas não-direcionadas por FIA-qTOF. Ao final do estudo I, a exposição a menor dose dos contaminantes levou ao desenvolvimento de intolerância à glicose e os animais expostos a 50 μg/kg/dia de BFA+BFS e 500 μg/kg/dia de BFS apresentaram aumento da massa corporal. A exposição a 50 μg/kg/dia de BFA causou hiperglicemia, 50 μg/kg/dia de BFA e BFA+BFS causaram aumento de colesterol total e HDL-colesterol e 500 μg/kg/dia de BFA também levou ao aumento deste último. A exposição ao BFS (500 μg/kg/dia) aumentou o LDL-colesterol. Proteínas hepáticas diferencialmente expressas nos grupos expostos a 50 μg/kg/dia de BFA ou BFS, em comparação ao grupo controle, estão relacionadas com a síntese de triglicérides (glucokinase activityrelated sequence 1, fold-change 1,8 para BFA e 2,4 para BFS) e com biossíntese do mevalonato (hydroxymethylglutaryl-CoA synthase cytoplasmic, fold-change 2 para BFS). Proteínas da cadeia transportadora de elétrons bem como enzimas antioxidantes também apresentaram expressão desregulada após a exposição a ambos contaminantes. Análises proteômicas do tecido pancreático mostraram que ambos os compostos reduziram drasticamente a expressão de diversas proteínas ribossomais, bem como de proteínas essenciais para a homeostase energética, tais como insulin-1 (fold-change 0,01 para BFA), insulin-2 (fold-change 0,01 para BFS) e glucagon (fold-change 0,01 para BFS) em comparação ao controle. Os ensaios de RT-qPCR confirmaram os resultados obtidos nas análises proteômicas para as vi proteínas analisadas. Os resultados do estudo II demonstraram efeitos antiproliferativos e citotóxicos em células HepG2 após a exposição a altas e baixas concentrações dos bisfenois (curvas de dose-resposta não-lineares), enquanto os mesmos regimes de exposição produziram efeitos mais brandos na proliferação e viabilidade de INS-1E, exceto para a mais alta concentração estudada de ambos compostos. As análises do metaboloma de HepG2 e de INS-1E revelaram tanto alterações moleculares tempo e dose-dependentes como vias semelhantes de toxicidade para os dois compostos. Este estudo mostra a importância da condução de estudos ômicos para a elucidação de mecanismos de toxicidade e a necessidade de se reavaliar o uso do BPS em substituição ao análogo BPA, uma vez que o BPS também produz alterações metabólicas importantes in vivo e in vitro.

Bisphenol A (BPA) and bisphenol S (BPS) are endocrine disruptors that can lead to the development of several metabolic disorders such as obesity, diabetes and dyslipidemias. Nonetheless the mechanisms associated to the toxic effects are not yet fully understood. In this context, this work aimed at elucidating BPA and BPS mechanisms of toxicity in in vivo and in vitro models, through evaluation of biochemical-metabolic and pathophysiological alterations by the analysis of affected metabolic pathways and by means of omic tools (proteomics and metabolomics). To this end, this work was divided into 2 main studies: (I) Male Wistar rats were chronically exposed (20 weeks) to approximately 50 or 500 μg/kg/day of BPA and/or BPS through drinking water (ethical approval n. 15.1.979.60.7). Body mass gain was weekly determined and Insulin Tolerance Test (ITT) and Glucose Tolerance Test (GTT) were performed, respectively, at the 18th and 19th weeks of exposure. Following euthanasia, blood samples were collected to determine biochemical parameters in all experimental groups and liver and pancreas samples were obtained from animals exposed to 50 μg/kg/day of BFA or BFS to quantify changes in protein expression through nontargeted proteomic analyses by nanoUPLC-nanoESI-HDMSE (n=3) and gene expression by RT-qPCR (n=6). (II) HepG2 and INS-1E cells were exposed for 72 h to BPA or BPS (100; 10; 1; 0.1; 0.01 and 0.001 μM) to assess cellular proliferation and viability; and intracellular polar extracts from both strains were obtained following 24, 48 and 72 h of exposure to BPA or BPS (10 - 0.001 μM) for basal metabolic characterization through non-targeted metabolomic analyses by FIA-qTOF. Data from study I indicates that exposure to the lowest dose of the contaminants led to the development of glucose intolerance and animals exposed to 50 μg/kg/day of BPA+BPS and 500 μg/kg/day of BPS showed an increase in body mass. Exposure to 50 μg/kg/day of BPA caused hyperglycemia, 50 μg/kg/day of BPA and BPA+BPS caused an increase in total cholesterol and HDL-cholesterol and 500 μg/kg/day of BPA also increased this last parameter. Exposure to BPS (500 μg/kg/day) increased LDLcholesterol. Hepatic proteins differentially expressed in groups exposed to 50 μg/kg/day of BPA or BPS, compared to the control group, are related to triglyceride synthesis (glucokinase activity-related sequence 1, 1.8-fold change for BPA and 2.4- fold change for BPS) and with mevalonate biosynthesis (hydroxymethylglutaryl-CoA synthase cytoplasmic, 2-fold change for BPS). Proteins from electron transport chain as well as antioxidant enzymes also presented dysregulated expression following exposure to both contaminants. Proteomic analyses from pancreatic tissues evidenced that both compounds drastically reduced expression of several ribosomal proteins as well as of essential proteins for energy homeostasis such as insulin-1 (0.01-fold change for BPA), insulin-2 (0.01-fold change for BFS) and glucagon (0.01-fold change for BPS) compared to the control group. RT-qPCR assays confirmed the results obtained in proteomic analyses for the proteins analyzed. Results from study II showed antiproliferative and cytotoxic effects in HepG2 cells after exposure to the highest and lowest-concentrations of the contaminants (nonlinear dose-response curve), while the same exposure regimens produced milder effects on INS-1E proliferation and viability, except for the highest concentration studied of both contaminants. HepG2 and INS-1E viii metabolome analyses revealed time- and dose-dependent molecular changes and similar toxicity pathways for both compounds. This study shows the importance of conducting omic studies for the unveiling of mechanisms of toxicity and the need to reevaluate the use of BPS as a substitute for BPA, since the first produced significant metabolic changes in vivo and in vitro.