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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.60.2021.tde-22032022-080114
Document
Author
Full name
Gisele Adriano Wiezel
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
Ribeirão Preto, 2021
Supervisor
Committee
Braga, Eliane Candiani Arantes (President)
Gaitani, Cristiane Masetto de
Araújo, Heloisa Sobreiro Selistre de
Beleboni, Renê de Oliveira
Title in Portuguese
Venoma da cascavel brasileira Crotalus durissus terrificus e caracterização de um inibidor recombinante de fosfolipase A2: um possível adjuvante na terapia do envenenamento
Keywords in Portuguese
Beta-PLI
Cascavel
Crotalus durissus terrificus
Inibidor de PLA2
PLI
Proteoma
Transcriptoma de glândula de peçonha
Venoma
Abstract in Portuguese
Os acidentes ofídicos no Brasil vêm aumentando ano a ano e são considerados um problema negligenciado de saúde pública. O único tratamento eficaz é a administração do soro antiofídico, mas reações adversas estão relacionadas à sua administração. A crotoxina, um complexo de fosfolipases A2 (PLA2), é um dos componentes mais estudados da peçonha crotálica, mas muitos outros componentes são menos conhecidos devido a sua baixa abundância. Portanto, o presente estudo objetivou a análise do transcriptoma da glândula e do proteoma da peçonha da serpente Crotalus durissus terrificus, bem como a caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de PLA2 (PLI) recombinante dessa serpente. A biblioteca de cDNA da glândula de peçonha foi construída usando a plataforma Illumina e o seu proteoma foi investigado através de cromatografia líquida de alta resolução acoplada à espectrometria de massas. A integração de ambos os conjuntos de dados permitiu a análise do venoma, sendo que mais de 30 famílias de componentes foram identificadas no transcriptoma, das quais 15 também foram detectadas no proteoma da peçonha. No entanto, poucas famílias (PLA2, SVMP, SVSP e VEGF) são relativamente abundantes e apenas 7 transcritos contribuem com ~82% e ~73% da abundância no transcriptoma e no proteoma, respectivamente. Também foram identificadas sequências de PLIs, que surgem como uma possibilidade de adjuvante na terapia do envenenamento. Esses inibidores são proteínas geralmente encontradas no sangue de serpentes que, recentemente, também têm sido identificadas em glândulas de peçonha. Sendo assim, o gene sintético do inibidor CdtPLI-2 foi expresso em células de Pichia pastoris KM71H em meio BMMY com casaminoácidos 1,5%. A seguir, o PLI recombinante rCdtPLI2 foi purificado do meio de cultura através de diferentes etapas cromatográficas e não foi reconhecido pelo soro anticrotálico comercial. O sequenciamento amino-terminal confirmou sua expressão e sua massa molecular foi determinada por MALDI-TOF (41643,599 Da). A digestão do rCdtPLI2 com PNGase F/alfa-manosidase permitiu análise de sua glicosilação e a retirada total do açúcar deixou a proteína insolúvel. O rCdtPLI2 glicosilado não é capaz de inibir PLA2 ofídicas, mas sua digestão com alfa-manosidase forneceu um inibidor deglicosilado com ação inibitória sobre PLA2 de diferentes peçonhas ofídicas brasileiras, incluindo PLA2 ácidas e básicas. As PLA2 CB-Cdc e Lmr-PLA2 são significativamente inibidas a partir da proporção de 1:10 (inibidor:toxina). Para a CTx-Cdc, grande inibição é vista a partir da proporção 1:5. Além disso, uma análise preliminar in vivo revelou que o rCdtPLI2 deglicosilado pode ser um agente promissor na diminuição do edema causado pela CTx-Cdc. O inibidor (brCdtPLI2) também foi expresso em células de E. coli BL21(DE3)pLysS em meio LB, com indução mantida por IPTG 0,5 mM. Posteriormente, o brCdtPLI2 foi isolado do lisado celular através de diferentes etapas cromatográficas e um ensaio de inibição mostrou que ele inibe a ação enzimática da CB-Cdc, apresentando-se promissor na inibição de outras PLA2 ofídicas e com a vantagem de ausência de glicosilações. Concluindo, esse trabalho forneceu um banco de dados holístico e abre o caminho para investigações e descobertas de futuros agentes farmacológicos ou alvos na terapia antivenenos.
Title in English
Venome of the Brazilian rattlesnake Crotalus durissus terrificus and characterization of a phospholipase A2 inhibitor: a possible adjuvant in the antivenom therapy
Keywords in English
Beta-PLI
Crotalus durissus terrificus
PLA2 inhibitor
PLI
Proteome
Rattlesnake
Venom gland transcriptome
Venome
Abstract in English
Snakebite accidents in Brazil have increased yearly and are considered a neglected public health problem. The only effective treatment is the administration of the snake antivenom, but adverse reactions are related to its administration. Crotoxin, a phospholipases A2 (PLA2) complex, is one of the most studied components in crotalic venom, but many other molecules are less known due to its extremely low abundance. Therefore, this study aimed the analysis of the venom gland transcriptome and the venom proteome of the snake Crotalus durissus terrificus as well as the biochemical and functional characterization of a recombinant PLA2 inhibitor (PLI) from this snake. The venom gland cDNA library was constructed using the Illumina platform and the proteome from this gland was investigated through high resolution liquid chromatography coupled with mass spectrometry. Integration of both datasets allowed the venome analysis, revealing more than 30 protein families in the transcriptome, of which 15 were also detected in the venom proteome. However, few families (PLA2, SVMP, SVSP e VEGF) are relatively abundant and only 7 transcripts correspond to, respectively, ~82% and ~73% of the transcriptome and proteome. Sequences of PLIs have also been identified, which appear as possible adjuvant in the antivenom therapy. These inhibitors are proteins usually found in snakes' blood, but they gave been detected in venom glands recently. Thus, the CdtPLI-2 synthetic gene was expressed in Pichia pastoris KM71H cells in BMMY with 1.5% casaminoacids medium. Next, the recombinant PLI rCdtPLI2 was purified from the culture medium by different chromatographic steps and it was not recognized by the commercial anticrotalic serum. N-terminal sequencing confirmed its expression, and its molecular mass was determined by MALDI-TOF (41643.599 Da). rCdtPLI2 digestion with PNGase F/alpha-mannosidase allowed the analysis of its glycosylation and the protein became insoluble after total sugar removing. The glycosylated rCdtPLI2 cannot inhibit snake venom PLA2, but its digestion with alpha-mannosidase provided a deglycosylated inhibitor with and inhibitory action on PLA2 from different Brazilian snake venoms including acid and basic PLA2. The PLA2 CB-Cdc and Lmr-PLA2 are significantly inhibited from the ratio 1:10 (inhibitor:toxin). On the other hand, great inhibition is observed from 1:5 ratio for CTx-Cdc. Besides that, an in vivo preliminary analysis revealed that the deglycosylated rCdtPLI2 may be a promising agent in reducing edema caused by CTx-Cdc. The inhibitor (brCdPLI2) was also expressed in E. coli BL21(DE3)pLysS cells in LB medium, with expression induction maintained by 0.5 mM IPTG. Subsequently, brCdtPLI2 was isolated from the cell lysate by different chromatographic steps, and an inhibition assay showed it inhibits the CB-Cdc enzyme action, presenting as a promising molecule in the inhibition of other snake venom PLA2. Moreover, brCdtPLI2 has advantage that there is no sugar content in its structure. Concluding, this study provided a holistic database and paves the way for investigations and discoveries of futures pharmacological agents or targets in antivenom therapies.
 
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Release Date
2023-11-19
Publishing Date
2022-04-13
 
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