As peçonhas de serpentes são consideradas ricas fontes de componentes com importantes ações farmacológicas. Portanto, estudar os diversos componentes presentes nessas peçonhas permite esclarecer a patogenia do envenenamento e identificar moléculas com potenciais aplicações biotecnológicas. No Brasil, as serpentes do gênero Crotalus, representado pela espécie Crotalus durissus, habitam diversas regiões do país e suas peçonhas são compostas por grande quantidade de proteínas (cerca de 95%), componentes não enzimáticos como carboidratos, cátions metálicos, aminas biogênicas, nucleosídeos, aminoácidos livres e uma pequena fração lipídica. No entanto, diversos componentes ainda não foram caracterizados, embora alguns já tenham sido identificados em análises ômicas (transcriptoma e proteoma), como é o caso do Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF) de Crotalus durissus terrificus. Os VEGFs são homodímeros não enzimáticos com massa molecular variando entre 20 e 30 kDa, com papel fundamental na angiogênese (crescimento de novos vasos), aumento de permeabilidade vascular, ação hipotensora, indução de migração celular e ação cardioprotetora em isquemias. No entanto, seu papel no envenenamento ainda não está totalmente elucidado. Diante disso, os objetivos do presente foram o isolamento e caracterização bioquímica, modificação química por bioconjugação com molécula de polietilenoglicol (PEGuilação) e avaliação funcional do VEGF da peçonha de Crotalus durissus terrificus (CdtVEGF). O isolamento do CdtVEGF foi realizado por meio de combinação de duas técnicas de cromatografia líquida como fase reversa e troca aniônica, respectivamente, sendo seu rendimento de 2%. A modificação química do CdtVEGF foi efetiva com a molécula de polietilenoglicol mPEG-maleimide de 5 kDa, sendo o PEG-CdtVEGF purificado por meio de cromatografia líquida de fase reversa em coluna C4 e esta PEGuilação foi confirmada por ELISA e espectrometria de massas (MALDI-TOF) com massa molecular de 31241.4 Da para o PEG-CdtVEGF. Por meio de análise em SDS-PAGE, o CdtVEGF migrou como homodímero sendo confirmado por espectrometria de massas por MALDI-TOF apresentando massas moleculares de 25524.0 Da para o dímero e 13315.7 Da para o monômero. Por LC/MS/MS foi possível determinar uma sequência para o CdtVEGF formado por 114 resíduos de aminoácidos. Por ELISA foi possível observar que o soro anticrotálico produzido pelo Instituto Butantan reconhece o CdtVEGF e, por análise in silico, foram identificados 12 possíveis epítopos imunogênicos na molécula. Por meio de análise in vitro, CdtVEGF nativo e PEG-CdtVEGF tiveram influência na atividade metabólica de células endoteliais vasculares umbilicais (HUVECs) de linhagem humana, em todas as concentrações testadas (0,01; 0,1; 1; 5; 10 e 100 nM) sendo que essa influência está relacionada com a proliferação destas células. Além disso, as proteínas (5 nM) induziram migração celular da mesma linhagem, no ensaio de wound healing sendo que o CdtVEGF nativo teve uma atividade mais potente que o PEG-CdtVEGF. Nos ensaios in vivo, realizados com camundongos machos da linhagem C57Bl/6, o CdtVEGF nativo (0,01; 1 e 5 nM) foi capaz de influenciar no recrutamento de leucócitos para a cavidade intraperitoneal dos animais de maneira dose-dependente, aumentando preferencialmente o influxo de neutrófilos. Sua ação sobre a permeabilidade vascular foi confirmada com o aumento de proteínas nos exsudatos peritoneais. Interessantemente, o PEGCdtVEGF, nas mesmas concentrações testadas, não teve influência nesses parâmetros, indicando que a PEGuilação foi capaz de diminuir a resposta inflamatória local que o CdtVEGF induziu. Este trabalho apresenta grande relevância científica por ser pioneiro no que se refere à purificação, PEGuilação e estudo funcional de um VEGF da peçonha de C. d. terrificus. Adicionalmente, os resultados obtidos contribuem para a aplicação desta molécula em modelos de estudo de doenças isquêmicas, cicatrização de feridas, além de poder ser utilizada como uma ferramenta molecular no estudo de patologias que envolvem a angiogênese.

Snake venoms are considered rich sources of components with important pharmacological actions. Therefore, the study of the diverse components presents in these venoms allows to clarify the pathogenesis of the envenoming and identify molecules with biotechnological applications. In Brazil, snakes from Crotalus genus, represented by the Crotalus durissus species, inhabit several regions of the country and their venoms are mostly composed by proteins (95%), non-enzymatic components such as carbohydrates, metal ions, amines, nucleosides, free amino acids, and a small lipid fraction. However, several components have not yet been characterized, although have already been identified through omics analysis (transcriptome and proteome), as it is the case of Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) from Crotalus durissus terrificus. VEGFs are non-enzymatic homodimers with molecular masses from 20 to 30 kDa, playing fundamental role on angiogenesis (growth of new vessels), inducing vascular permeability, hypotension, induction of cellular migration and cardioprotective role in ischemia. Nonetheless, its role in snake envenoming is not yet totally elucidated. Thus, the objectives of this study were the isolation and biochemical characterization, chemical modification using bioconjugation with a polyethylenoglycol molecule (PEGylation) and the functional evaluation of the VEGF from Crotalus durissus terrificus (CdtVEGF). The isolation of CdtVEGF was accomplished using two liquid chromatographic techniques with reversed phase and anionic exchange, respectively, with a yield of 2%. The chemical modification was effective with mPEGmaleimide molecule of 5 kDa, being PEG-CdtVEGF purified through reversed phase using a C4 column and this PEGylation was confirmed with ELISA assay and mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis with a molecular mass of 31241,4 Da for PEG-CdtVEGF. Through SDS-PAGE, CdtVEGF migrated as homodimer being confirmed with mass spectrometry by MALDI-TOF with a molecular mass of 25524,0 Da for the dimer and, 13315,7 Da for the monomer. Also, through LC/MS/MS it was possible to determine a sequence for CdtVEGF with 114 amino acids residues. By ELISA it was possible to observe that the anticrotalid serum produced by Butantan Institute was able to recognize CdtVEGF and, in silico analysis, demonstrated 12 immungenic epitopes in the molecule. Through in vitro analysis, native CdtVEGF and PEG-CdtVEGF had influence on metabolic activity of human umbilical endothelial cells (HUVECs) in all tested concentrations (0,01; 0,1; 1; 5; 10 and 100 nM) knowing that this influence is related to proliferation of these cells. Besides that, the proteins (5nM) induced cellular migration, in wound healing assay, being that native CdtVEGF had a more potent activity than PEG-CdtVEGF. In vivo assays were performed using male C57Bl/6 mice, native CdtVEGF (0,01; 1 and 5 nM) was able to influence at the leucocyte recruitment to the peritoneal cavity of the animals in a dose-dependent manner being the influx of neutrophils the preference cells. Its action on vascular permeability was confirmed with the protein increase in peritoneal exudates. Interestingly, PEG-CdtVEGF, at the same concentrations, did not show influence on these parameters, indicating that PEGylation was able to shield CdtVEGF from immune system. This work is of great scientific importance being pioneer regarding purification, PEGylation and functional study of a VEGF from C. d. terrificus snake venom. Additionally, the results obtained contributes for the application of this molecule in studies involving models of ischemic diseases, wound healing and in addition to being able to be used as a molecular tool in the study of pathologies involving angiogenesis.